用于慢性乙型肝炎的生物标志物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种基于CHB患者或健康对照中富集的OTU评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法。本发明专利技术还提供了一种基于这些OTU监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于慢性乙型肝炎的生物标志物及其用途
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围的流行病负担，到2005年，估计有2.4亿患者患有慢性乙型肝炎(CHB)疾病(1)。CHB增加了发生肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)的风险，据估计后两者每年在全球分别导致310,000和340,000例死亡(2)。迫切需要系统策略，以继续监测和预防CHB患者中严重肝衰竭的进程(3)。据报道，HBV感染与肠道菌群的菌群失调有关，其包括门静脉内细菌转移和内毒素负荷的增加，导致肝脏Toll样受体(TLR)和NOD样受体(NLR)的活化。TLR/NLR通过诱导包括核因子κB(NF-κB)转录途径的信号级联和加速诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞因子来激活宿主全身的促炎症反应，这也对肝脏组织产生不利影响以参与慢性炎症和肝病的发程(4-7)。反之，肝脏代谢产物(例如胆汁酸)也通过肝门和胆汁分泌系统的显著影响肠道菌群的构建(8)。在不存在肠道菌群的情况下，保护无菌小鼠免受病毒性肝病的侵袭(9)。在人类患者中，可以在不同的分类学水平上观察到肠道菌群失调。Lu等人报道了HBV感染患者的双歧杆菌(Bifidobacteria)/肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(B/E)比率显著降低，表明肠道的微生物定殖抗性受损(10)。Xu等人还进行了物种级别的研究，以揭示在相同的双歧杆菌属中，具有潜在益处的物种在HBV患者中显著减少，而机会致病性物种则显著增加(11)。通过益生元疗法改变肠道菌群的组成，可以减轻乙型和丙型肝炎患者的内毒素血症(12)。上面的研究表明，改变的肠道菌群通过诱导内毒素血浆水平和促进炎症以提供对感染的肝脏组织的二次打击，从而在肝病中发挥重要作用。然而，关于CHB患者的已发表研究依赖于对16SrRNA基因的定量PCR，这需要针对每个目的属或种专门设计的PCR引物，因此在肠道失调的通量和概述方面存在局限性。随着测序技术和多组学策略的快速发展，有必要深入了解CHB患者的肠道微生物组的详细组成和功能变化及其对肝衰竭进程的影响。
技术实现思路
本申请使用IlluminaMiSeq高通量测序平台来揭示患有肝病(特别是慢性乙型肝炎(CHB))的患者中肠道微生物组的变化。结果，发现多种OTU(操作分类单位)在CHB患者或健康对照中富集。这些OTU可以用作生物标记物，以高效、准确且患者友好地表征肝病，尤其是慢性乙型肝炎。在一方面，本专利技术提供了一种评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法，其包括以下步骤：a)收集受试者的粪便样品；b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTUIDNo.:1-12的每个参考OTU的丰度；c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTUIDNo.:1-3的丰度之和/3–OTUIDNo.:4-12的丰度之和/9；和d)如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有肝病或慢性乙型肝炎或处于患肝病或慢性乙型肝炎的风险中，其中，OTUIDNo.:1-12分别包含SEQIDNo:1-12所示的核酸序列。在一些实施方案中，步骤b)中的DNA分析包括以下步骤：获得粪便样品中微生物的系统发生信息基因的序列，并将获得的序列与SEQIDNo:1-12所示的核酸序列进行比对。在一些实施方案中，所述系统发生信息基因是16srRNA基因。在优选的实施方案中，所述系统发育信息基因是16SrRNA的V3-V4。在一些实施方案中，获得微生物的系统发生信息基因的序列包括以下步骤：获得样品中微生物的系统发生信息基因的原始序列读段，并处理所述原始序列读段以获得合格序列。在一些实施方案中，通过基于PCR的高通量测序技术获得微生物的系统发生信息基因的原始序列读段。在一些实施方案中，原始序列读段是通过使用IlluminaTM测序仪的Illumina测序获得。在一些实施方案中，原始序列读段的处理包括序列合并、错误校正和质量控制。在一些实施方案中，序列合并包括序列组合以提供完整的序列。在一些实施方案中，错误校正包括错误序列的校正。在一些实施方案中，质量控制包括去除引物、修整3'末端序列直到达到质量阈值为20的第一核苷酸、去除短序列、去除嵌合体、去除不能与SILVA细菌参考数据库中16SrRNA的高变区V3-V4比对的序列以及去除与人类基因组或不属于细菌的基因组比对的序列。在一些实施方案中，被去除的短序列为400bp或更少。在一些实施方案中，使用UCHIME(19)从头算法，使用丰富序列(abundantsequence)作为参照去除嵌合体。在一些实施方案中，随机挑选10000个合格序列用于步骤b)中的比对。在一些实施方案中，使用在比对中与SEQIDNo.:1-12具有97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％同一性的序列来确定每个参考OTU的丰度。在一些实施方案中，所述预定水平约为-61.5。在另一方面，本专利技术提供了一种用于监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法，其包括以下步骤：a)在疾病治疗或饮食干预之前和疾病治疗或饮食干预期间收集受试者的粪便样品；b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTUIDNo.:1-12的每个参考OTU的丰度；c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTUIDNo.:1-3的丰度之和/3–OTUIDNo.:4-12的丰度之和/9；和d)如果在疾病治疗或饮食干预期间GDI降低，则确定受试者对疾病治疗或饮食干预产生积极反应，其中，OTUIDNo.:1-12分别包含SEQIDNo:1-12所示的核酸序列。在一些实施方案中，步骤b)中的DNA分析包括以下步骤：获得粪便样品中微生物的系统发生信息基因的序列，并将获得的序列与SEQIDNo:1-12所示的核酸序列进行比对。在一些实施方案中，所述系统发生信息基因是16srRNA基因。在优选的实施方案中，所述系统发生信息基因是16SrRNA的V3-V4。在一些实施方案中，获得微生物的系统发生信息基因的序列包括以下步骤：获得样品中微生物的系统发生信息基因的原始序列读段，并处理所述原始序列读段以获得合格序列。在一些实施方案中，通过基于PCR的高通量测序技术获得微生物的系统发生信息基因的原始序列读段。在一些实施方案中，原始序列读段是通过使用IlluminaTM测序仪进行Illumina测序获得。在一些实施方案中，原始序列读段的处理包括序列合并、错误校正和质量控制。在一些实施方案中，序列合并包括序列组合以提供完整的序列。在一些实施方案中，错误校正包括错误序列的校正。在一些实施方案中，质量控制包括去除引物、修整3'末端序列直到达到质量阈值为20的第一核苷酸、去除短序列、去除嵌合体、去除不能与SILVA细菌参考数据库中16SrRNA的高变区V3-V4比对的序列以及去除与人类基因组或不属于细菌的基因组比对的序列。在一些实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法，其包括以下步骤：/na)收集受试者的粪便样品；/nb)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTU ID No.:1-12的每个参考OTU的丰度；/nc)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTU ID No.:1-3丰度之和/3–OTU ID No.:4-12丰度之和/9；和/nd)如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有肝病或慢性乙型肝炎或处于患肝病或慢性乙型肝炎的风险中，/n其中，OTU ID No.:1-12分别包含SEQ ID No:1-12所示的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种评估受试者中肝病或慢性乙型肝炎的存在或发生风险的方法，其包括以下步骤：
a)收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTUIDNo.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTUIDNo.:1-3丰度之和/3–OTUIDNo.:4-12丰度之和/9；和
d)如果GDI接近或高于预定水平，则确定受试者患有肝病或慢性乙型肝炎或处于患肝病或慢性乙型肝炎的风险中，
其中，OTUIDNo.:1-12分别包含SEQIDNo:1-12所示的核酸序列。


2.一种监测患有肝病或慢性乙型肝炎的受试者对疾病治疗或饮食干预的反应的方法，其包括以下步骤：
a)在疾病治疗之前和疾病治疗期间收集受试者的粪便样品；
b)分析从粪便样品中提取的DNA，以确定选自OTUIDNo.:1-12的每个参考OTU的丰度；
c)基于丰度数据计算肠道菌群失调指数(GDI)，其中GDI＝OTUIDNo.:1-3丰度之和/3–OTUIDNo.:4-12丰度之和/9；和
d)如果在疾病治疗或饮食干预期间GDI降低，则确定受试者对所述疾病治疗或饮食干预产生积极反应，
其中，OTUIDNo.:1-12分别包含SEQIDNo:1-12所示的核酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的DNA分析包括以下步骤：获得粪便样品中微生物的系统发生...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立平，王景，
申请(专利权)人：完美中国有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44