来自细菌的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途制造技术

本发明专利技术涉及细菌(例如放线菌属细菌)的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途。本发明专利技术还涉及编码上述III型聚酮合酶的分离的核酸分子，以及包含这种核酸分子的载体和宿主细胞。本发明专利技术还涉及生产间苯三酚的方法。

The use of polyketide III synthases from bacteria as phloroglucinol synthases

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自细菌的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途
本专利技术属于微生物生物化学的领域，更具体而言，属于通过微生物酶合成间苯三酚的领域。本专利技术涉及来自细菌(特别是来自放线菌属细菌)的III型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途。
技术介绍
间苯三酚是一种芳香族有机化合物，特别用于医药产品和爆炸物的生产中。间苯三酚合成被称为间苯三酚合酶的III型聚酮合酶催化。根据以下反应流程，间苯三酚合酶进行三个丙二酰基-CoA分子的缩合反应，从而形成间苯三酚分子(反应I)：反应I随后可以从间苯三酚合成许多低聚物，例如褐藻多酚。褐藻多酚具体包括多羟基联苯(fucols)、根皮素(phloretol)和岩藻糖根皮素(fucophloretol)，它们是由间苯三酚衍生的产物，其构成褐藻的壁。另外，褐藻的各种保护活性也归因于褐藻多酚。目前，仅在革兰氏阴性荧光假单胞菌细菌(Achkar等人,2005；Zha等人,2006)和褐藻外子藻(Ectocarpussiliculosus)(Meslet-Cladière等人,2013)中描述了间苯三酚的合成。在这两个物种中已鉴定出参与间苯三酚合成的间苯三酚合酶。它们是迄今为止鉴定和表征的仅有的两种间苯三酚合酶。在荧光假单胞菌中，间苯三酚合酶由PHLD基因编码(Achkar等人,2005；Zha等人,2006)。在外子藻中，间苯三酚合酶由PKS1基因编码(Meslet-Cladière等人，2013)。有可能在表达异源PHLD基因的大肠杆菌(Escherichiacoli)中证明PHLD间苯三酚合酶的活性(Achkar等人,2005)。通过用从大肠杆菌培养物中表达和纯化的重组PHLD进行的小规模酶学测试，已在体外证实了这种活性(Zha等人，2006)。已经在体外通过大肠杆菌中表达和纯化的重组PKS1以及外子藻(E.siliculosus)的细胞提取物证明了PKS1间苯三酚合酶的活性(Meslet-Cladière等人,2013,WO2013/045510)。但是，PHLD和PKS1酶表现出较低的酶活性。另外，尚未证明使用这些酶在体外大规模合成间苯三酚的可能性。最后，在这些研究中使用的间苯三酚合酶是由大肠杆菌或荧光假单胞菌细菌产生的。因此，当这些酶由真核生物(例如酵母或昆虫或哺乳动物细胞)产生时，其活性是未知的。然而，真核系统可能是有利的，特别是对于大规模生产。实际上，它们使获得在翻译后水平上修饰的酶成为可能。因此，仍然需要鉴定在体外或体内具有高间苯三酚合酶活性的新的间苯三酚合酶，其适于工业规模生产并且可以通过真核系统来生产。然而，聚酮合酶的确切功能表征由于以下事实而变得复杂：该类酶将具有大的序列相似性的蛋白质汇集在一起，而他们可以催化基本不同的反应并识别完全不同的底物。尽管存在这些困难，本专利技术人仍能够鉴定出细菌中存在的并具有间苯三酚合酶活性的多肽。因此，已经鉴定出新的间苯三酚合酶，特别是在革兰氏阳性细菌中。它们构成了这种类型细菌中间苯三酚合酶的第一个示例。专利技术人在此证明这些新的间苯三酚合酶表现出高的间苯三酚合成活性。因此，它们适合于工业规模的生产。此外，当在真核系统中产生时，它们是有功能的。
技术实现思路
在本专利技术的上下文中，专利技术人完全出乎意料地证明，除了荧光假单胞菌外，细菌在其基因组中包含编码具有功能性间苯三酚合酶活性的III型聚酮合酶的基因。因此，本专利技术涉及选自细菌的III型聚酮合酶，特别是来自革兰氏阳性细菌的III型聚酮合酶，特别是来自放线菌属细菌的III型聚酮合酶的多肽，其可以用作间苯三酚合酶。本专利技术还涉及分离的核酸分子，其编码来自细菌的间苯三酚合酶，特别是编码来自革兰氏阳性细菌的间苯三酚合酶，特别是编码来自放线菌属细菌的III型聚酮合酶，并且还涉及由此编码的间苯三酚合酶。本专利技术还涉及包含至少一个编码这种间苯三酚合酶的分离的核酸分子的载体。本专利技术还涉及包含至少一个根据本专利技术的分离的核酸分子或至少一个载体的宿主细胞。本专利技术还涉及生产功能性间苯三酚合酶的方法。本专利技术还涉及生产间苯三酚的方法。附图说明图1显示了鉴定的候选酶的蛋白质序列比对。使用ClustalW软件将十种选定的酶与酶PKS1.Es(PHLD.Es)进行比对。图2显示了在丙基五氟苯基(PFP)柱上间苯三酚/间苯二酚分离的实例。图3显示了为给定候选物(PhlD.ii)构建的基因单元结构的实例，这使得可以在酵母酿酒酵母中表达PHLD基因。图4显示了在存在20g.L-1的乙醇作为碳源、在30℃下在24孔板中培养48小时后，在ADH2启动子控制下表达各种候选基因PHLD.ii和对照PHLD.Pf和PKS1.Es基因(几个拷贝)的酵母菌株中间苯三酚的生产水平。(A)各种测得数据的总结。(B)在600nm(DO600)下测得的各种培养物的光密度(DO)，表明每种菌株的生长水平。(C)在培养基中测得的间苯三酚生产水平(以mg.L-1计)。(D)相对于整合到基因组中的基因拷贝数归一化的间苯三酚的生产水平(以mg.1-1计)。图5显示了在JLP1基因座上整合到酵母基因组中的基因构建体的结构。编码每个PHLD/PKS1的基因在pADH2启动子或pCCW12启动子的控制下。图6显示了在存在20g.L-1的乙醇作为碳源、在30℃下在24孔板中培养48小时后，在ADH2启动子控制下表达各种PHLD.ii基因(仅1个拷贝)的酵母菌株中间苯三酚的生产水平。(A)各种测得数据的总结。(B)在600nm(DO600)下测得的各种培养物的光密度(DO)，表明每种菌株的生长水平。(C)在培养基中测得的间苯三酚生产水平(以mg.L-1计)。图7显示了在存在20g.L-1的葡萄糖作为碳源、在30℃下在24孔板中培养48小时后，在CCW12启动子控制下表达各种PHLD基因(仅1个拷贝)的酵母菌株中间苯三酚的生产水平。(A)各种测得数据的总结。(B)在600nm(DO600)下测得的各种培养物的光密度(DO)，表明每种菌株的生长水平。(C)在培养基中测得的间苯三酚生产水平(以mg.L-1计)。具体实施方式定义术语“III型聚酮合酶”旨在表示产生聚酮的多功能酶或酶复合物，并且不使用酰基载体蛋白(或ACP)结构域。术语“聚酮”旨在表示细菌、霉菌、植物和某些动物品系中一个大的次级代谢产物家族，其源自聚酮合酶对乙酰基或丙二酰亚基的反复缩合。聚酮还用作生产各种天然和半合成产品的起始原料。术语“间苯三酚”旨在表示具有以下化学式(式I)的芳香族有机化合物苯-1,3,5-三醇：术语“间苯三酚合酶”旨在表示属于III型聚酮合酶家族并且催化间苯三酚合成的多功能酶或酶复合物。间苯三酚合酶催化三个丙二酰基-CoA分子的缩合，从而形成间苯三酚分子。术语酶的“酶活性”或“催化活性”或“活性”旨在表示在给定环境中将底物转化为产物的酶的效率。酶的效率在本文本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.至少一种选自细菌的III型聚酮合酶的多肽作为间苯三酚合酶的用途，但不包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PHLD.Pf的III型聚酮合酶。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 FR 17561061.至少一种选自细菌的III型聚酮合酶的多肽作为间苯三酚合酶的用途，但不包括荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PHLD.Pf的III型聚酮合酶。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述多肽选自放线菌属细菌的III型聚酮合酶。


3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述多肽包含与选自SEQIDNo：4、SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10的序列具有至少50％同一性的至少一个氨基酸序列。


4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性放线菌属细菌选自冢卡氏菌属(Tsukamurellasp.)、诺卡氏菌属(Nocardiasp.)、分枝杆菌属(Mycobacteriumsp)和戈登菌属(Gordoniasp.)，特别是肺冢卡氏菌(Tsukamurellapulmonis)、微变冢卡氏菌(Tsukamurellapaurometabola)、溶酪氨酸冢卡氏菌(Tsukamurellatyrosinosolvens)、假单胞冢卡氏菌(Tsukamurellapseudospumae)、冢卡氏菌属1534(Tsukamurellasp.1534)、皮诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和疏水性戈登菌(Gordoniahydrophobica)。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于所述多肽包含与选自SEQIDNo：4、SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10的序列具有至少60％同一性、更优选至少65％同一性、更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、还更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、更优选至少96％同一性、甚至更优选至少97％同一性、还更优选至少98％同一性、甚至更优选至少99％同一性的至少一个氨基酸序列。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其特征在于所述多肽包含选自SEQIDNo：4、SEQIDNo：1、SEQIDNo：2、SEQIDNo：3、SEQIDNo：5、SEQIDNo：6、SEQIDNo：7、SEQIDNo：8、SEQIDNo：9和SEQIDNo：10中的至少一个氨基酸序列。


7.分离的核酸分子，其包含至少一个编码权利要求1至6中任一项所定义的多肽的核酸序列，并且还包含控制所述至少一个核酸序列的表达的启动子。


8.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其特征在于所述启动子是外源性启动子，特别是酵母启动子。


9.分离的核酸分子，其包含至少一个编码如权利要求1至6中任一项所定义的多肽的核酸序列，并且还包含控制所述至少一个核酸序列的表达的终止子。


10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其特征在于所述终止子是外源性终止子，特别是酵母终止子。

【专利技术属性】
技术研发人员：V·拉法基尔，O·拉曼，D·路易斯，
申请(专利权)人：米其林集团总公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR