一种同时测定五种神经递质含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时测定五种神经递质含量的方法，属于药物检测技术领域。本发明专利技术所述方法中，待测样品采用高效液相色谱‑电喷雾‑串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ‑氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5‑羟色胺。通过对色谱条件和质谱条件进行具体限定，本发明专利技术采用HPLC‑MS/MS方法能够准确的同时测定五种神经递质的含量，为从神经递质的角度研究治疗脑缺血再灌注损伤药物的开发提供一定的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定五种神经递质含量的方法
本专利技术涉及药物检测
，具体涉及一种同时测定五种神经递质含量的方法。
技术介绍
神经递质是在神经化学传递中充当“信使”的特定化学物质。脑内神经递质分为4类，即氨基酸类、单胺类、肽类和其它类，其中氨基酸类分为兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸，在生理状态下可参与突触的传递，促进学习记忆，但在病理状态下，兴奋性神经递质如谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)等含量升高，触发中枢神经系统过度兴奋，抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)等含量降低，导致神经系统能量代谢失衡，产生神经毒性作用。单胺类神经递质改变，能够通过促进自由基产生、促进兴奋性神经递质释放和细胞内钙超载等多种途径，引发一系列病理生理效应，最终导致细胞凋亡或坏死。5-HT是一种单胺类神经递质，正常情况下，5-羟色胺(5-HT)从脑干中缝核和蓝斑核神经元发出神经纤维后，投射至脑组织中海马和皮质等部位，参与机体调节心脑血管疾病、饮食、睡眠等。缬氨酸是一种支链氨基酸，在大脑中参与星形胶质细胞和神经元间的谷氨酸及谷氨酸循环，且研究发现大鼠经MCAO(大脑中动脉阻塞)损伤手术后，体内代谢将会发生紊乱。微透析是从神经化学领域发展起来的，可作用于靶器官、组织、细胞，并对特定靶点中内源性及外源性物质进行实时在线取样的一门新兴技术，且不破坏生物体的内环境，具有灵敏度高、准确度良好、时间分辨性准确、且无需预处理透析液等优点，并能节省时间及成本，且个体差异相对较小，是体内药物分析的重大突破。近年来，用于透析液中氨基酸分析的方法有高效液相电化学检测法、高效液相荧光检测法、高效液相色谱质谱法等，其中高效液相荧光检测法较为常用，但该法需进行衍生化处理，操作繁琐且影响结果的因素较多，而高液相色谱-电喷雾-串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)不需衍生试剂处理，进样量少，操作方便且灵敏度高，是目前普遍适用于与微透析结合进行分离、分析的技术。目前已报道的测定脑脊液中神经递质的HPLC-ESI-MS/MS方法仍然需对脑脊液进行一定的处理，而且尚未对同时测定缬氨酸进行报道。因此，开发一种不需要对脑脊液样品进行处理、能够直接准确测定脑脊液中包括缬氨酸在内的多种神经递质的测定方法至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时测定五种神经递质含量的方法。本专利技术采用HPLC-MS/MS方法能够准确的同时测定五种神经递质的含量，为从神经递质的角度研究治疗脑缺需再灌注损伤药物的开发提供一定的技术支撑。本专利技术提供了一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；所述测定的条件为：色谱条件：色谱柱为SynergiTMHydro-RPC18，柱内径×长度为4.6mm×150mm，粒径为4μm；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，所述0.1％甲酸水为含0.1％体积分数甲酸的水溶液，所述0.1％甲酸乙腈为含0.1％体积分数甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱：0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％；1～2min，流动相A为95％～70％，流动相B为5％～30％；2～5min，流动相A为70％～5％，流动相B为30％～95％；5～6min，流动相A为5％，流动相B为95％；6～7min，流动相A为5％～95％，流动相B为95％～5％；7～10min，流动相A为95％，流动相B为5％；流速为0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；质谱条件：采用电喷雾电离源电离模式；多反应检测采集方式；离子源温度550℃；电喷雾电压：4500V；雾化气：55psi；辅助加热器气：55psi，气帘气：35psi。优选的是，所述测定为定量和/或定性测定。本专利技术提供了一种同时测定五种神经递质含量的方法。本专利技术所述方法能够快速、高效、灵敏、准确的同时测定待测样品中五种神经递质含量。本专利技术的优势在于不需要对脑脊液样品进行处理、能够直接准确测定脑脊液中包括缬氨酸在内的五种神经递质的含量。试验结果表明，本专利技术所建立的HPLC-MS/MS方法能够准确测定正常大鼠和MCAO模型大鼠海马透析液中五种神经递质的含量。附图说明图1-A-1为本专利技术提供的人工脑脊液中γ-氨基丁酸的色谱图；图1-B-1为本专利技术提供的混合对照品中γ-氨基丁酸的色谱图；图1-C-1为本专利技术提供的大鼠脑脊液微透析样品中γ-氨基丁酸的色谱图；图1-A-2为本专利技术提供的人工脑脊液中天门冬氨酸的色谱图；图1-B-2为本专利技术提供的混合对照品中天门冬氨酸的色谱图；图1-C-2为本专利技术提供的大鼠脑脊液微透析样品中天门冬氨酸的色谱图；图1-A-3为本专利技术提供的人工脑脊液中谷氨酸的色谱图；图1-B-3为本专利技术提供的混合对照品中谷氨酸的色谱图；图1-C-3为本专利技术提供的大鼠脑脊液微透析样品中谷氨酸的色谱图；图1-A-4为本专利技术提供的人工脑脊液中缬氨酸的色谱图；图1-B-4为本专利技术提供的混合对照品中缬氨酸的色谱图；图1-C-4为本专利技术提供的大鼠脑脊液微透析样品中缬氨酸的色谱图；图1-A-5为本专利技术提供的人工脑脊液中5-羟氨酸的色谱图；图1-B-5为本专利技术提供的混合对照品中5-羟氨酸的色谱图；图1-C-5为本专利技术提供的大鼠脑脊液微透析样品中5-羟氨酸的色谱图。具体实施方式本专利技术提供了一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；在本专利技术中，所述高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法优选使用API5500/Q-TRAP型高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(AcquityHPLC系统，Analyst，Multiquant工作站，包括二元高压梯度泵、自动进样器、电喷雾电离源等)。所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；本专利技术对所述神经递质的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺市售产品即可，如谷氨酸(Glu，批号：BCRW2718)，γ-氨基丁酸(GABA，批号：BCBX6886)、天冬氨酸(Asp，批号：BCBR3884)对照品、缬氨酸、5-羟色胺均购置于美国Sigma公司，纯度均>99％。本专利技术所建立的HPLC-MS/MS方法能够准确同时测定正常大鼠和MCAO模型大鼠海马透析液中五种神经递质的含量，将有利于从干预五种神经递质的角度筛选脑保护作用的药物。所述测定的条件为：色谱条件：色谱柱为SynergiTMHydro-RPC18，柱内径×长度为4.6mm×150mm，粒径为4μm；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，所述0.1％甲酸水为含0.1％体积分数甲酸的水溶液，所述0.1％甲酸乙腈为含0.1％体积分数甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；所述测定的条件为：/n色谱条件：色谱柱为Synergi

【技术特征摘要】
1.一种同时测定五种神经递质含量的方法，待测样品采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱方法进行测定；所述神经递质为谷氨酸、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、缬氨酸和5-羟色胺；所述测定的条件为：
色谱条件：色谱柱为SynergiTMHydro-RPC18，柱内径×长度为4.6mm×150mm，粒径为4μm；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，所述0.1％甲酸水为含0.1％体积分数甲酸的水溶液，所述0.1％甲酸乙腈为含0.1％体积分数甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脱：
0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％；
1～2min，流动相A为95％～70％，流动相B为5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩仔鹏，王爱民，张楠，陈艳，李月婷，王广成，陈思颖，黄勇，郑林，李勇军，兰燕宇，王永林，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52