检测Neofusicoccum algeriense的LAMP引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一套检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccum algeriense)的LAMP引物及试剂盒。所述LAMP引物包括外侧正、反向引物以及内侧正、反向引物，它们的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑4所示。本发明专利技术将LAMP引物恒温扩增技术用于Neofusicoccum algeriense病菌的快速检测，可从发病植物组织及苗木中复杂的病原菌环境准确地检测出该致病菌。该方法的特异性、灵敏度及可重复性均较常规PCR方法更高，对Neofusicoccum algeriense早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可避免高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

Lamp primers and kits for detecting neoficium algeriense

【技术实现步骤摘要】
检测Neofusicoccumalgeriense的LAMP引物及试剂盒
本专利技术属于微生物检测
，具体地说，涉及一种检测Neofusicoccumalgeriense的LAMP引物及试剂盒。
技术介绍
葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaericeae)侵染引起的蓝莓茎溃疡病(BlueberryStemBlight)，目前在我国主要蓝莓产区已有发生报道，对中国蓝莓产业健康发展带来严重危害。该菌从蓝莓植株的伤口或自然孔口进行侵染，导致皮层和韧皮部的枯死在田间引起蓝莓枝条枯萎、木质部坏死及植株死亡等症状。目前，葡萄座腔菌科中已有多种能引发此病害(Botryosphaeriacortices，Botryosphaeriadothidea，Fusicoccumaesculin，Lasiodiplodiachinesis，Lasiodiplodiatheobromae，Lasiodiplodiavaccinii，Neofusicoccumalgeriense，Neofusicoccumarbuti，Neofusicoccumaustral，Neofusicoccumparvum，Neofusicoccumribis)，其中Neofusicoccumalgeriense是一种强致病菌，病部皮层组织变软变黑，易剥离，可在蓝莓枝条表面形成红棕色至黑色病斑，组织坏死，可见椭圆状至不规则形状褐色溃疡病斑，蔓延至整个枝条，引起维管束坏死和整枝枯萎死亡，该菌主要在枝条病斑内越冬，在适宜条件下产生分生孢子，借助通过自然孔口或机械伤口侵入田间植株，侵染后，菌丝迅速扩展到维管组织，通过细胞间隙横向发展，最终，在愈伤组织、皮层、木质部、管胞或导管等各种类型的细胞中定殖。该菌有潜伏侵染的特性，通常作为腐生菌在土壤中或植物内生菌在健康的植株中存在，当遇到高温、积水、风害等逆境条件时便开始侵染植株。因此，对该类病菌的初侵染源早期进行适时监控，对于该病害的防控有重要意义，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。普通PCR技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于基层推广。自环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)建立以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测研究。LAMP技术作为一种恒温核酸扩增技术，其最大的优点在于反应速度快、设备简单，而且结果易于鉴定，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前尚未见利用LAMP技术检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)的LAMP引物及试剂盒。本专利技术的另一目的是提供基于LAMP技术的蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)检测方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种用于检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)的LAMP引物，所述LAMP引物为(SEQIDNO：1-4)：外侧正向引物F3：5’-CCGGCAAGTCTATTGAGAACA-3’；外侧反向引物B3：5’-CGGTTTGACGCTGTGGAA-3’；内侧正向引物FIP(F1C+F2)：5’-CACATGGGCTTGGAGGGAATCACCCCAAGTTCATCAAGTCTGG-3’；内侧反向引物BIP(B1C+B2)：5’-TGAGGCTTTCACCGAGTACCCCTGATTCAAGGTTCAAGGGAGG-3’。第二方面，本专利技术提供含有SEQIDNO：1-4所示的LAMP引物的检测试剂或试剂盒。第三方面，本专利技术提供蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)检测试剂盒，所述试剂盒包含SEQIDNO：1-4所示的LAMP引物，还包含dNTPs、BstDNA聚合酶、反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。第四方面，本专利技术提供SEQIDNO：1-4所示的LAMP引物、含有所述LAMP引物的检测试剂或试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)中的应用。第五方面，本专利技术提供蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)检测方法，包括以下步骤：1)提取待测样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用SEQIDNO：1-4所示的LAMP引物进行LAMP扩增反应(LAMP-PCR)；3)扩增结果判定。其中，步骤2)所用反应体系为：其中，所述反应体系中引物FIP和BIP按等量加入，引物F3和B3按等量加入，且引物FIP、BIP与引物F3、B3的总质量比为8∶1。优选采用如下反应体系：步骤2)所用反应条件为：61～65℃50～90分钟。优选采用如下反应条件：63℃60分钟，80℃2分钟。步骤3)可以采用如下①～③中的任一种方法进行扩增结果判定：①荧光染色法：向扩增产物中加入染料SYBRGreenI，进行显色反应，若反应体系由橙色(橘黄色)变为绿色，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)；或者，在扩增反应前向反应体系中加入钙黄绿素(Calcein)，扩增反应结束后，在紫外灯照射下反应体系显示荧光绿色，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)；或者，在扩增反应前向反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)，扩增反应结束后，若反应体系由紫色变为天蓝色，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)；②琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)；③焦磷酸镁浊度检测法：通过肉眼观察反应后的浑浊情况(或产生乳白色沉淀)来判断是否发生了LAMP扩增反应，或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，实现实时定量检测。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术将LAMP引物恒温扩增技术用于Neofusicoccumalgeriense病菌的快速检测，可从发病植物组织及苗木中复杂的病原菌环境准确地检测出该致病菌。该方法的特异性、灵敏度及可重复性均较常规PCR方法更高，检测灵敏度达0.0784fg/mL，对蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccum algeriense)的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物为：/n外侧正向引物F3：5’-CCGGCAAGTCTATTGAGAACA-3’；/n外侧反向引物B3：5’-CGGTTTGACGCTGTGGAA-3’；/n内侧正向引物FIP：5’-CACATGGGCTTGGAGGGAATCACCCCAAGTTCATCAAGTCTGG-3’；/n内侧反向引物BIP：5’-TGAGGCTTTCACCGAGTACCCCTGATTCAAGGTTCAAGGGAGG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物为：
外侧正向引物F3：5’-CCGGCAAGTCTATTGAGAACA-3’；
外侧反向引物B3：5’-CGGTTTGACGCTGTGGAA-3’；
内侧正向引物FIP：5’-CACATGGGCTTGGAGGGAATCACCCCAAGTTCATCAAGTCTGG-3’；
内侧反向引物BIP：5’-TGAGGCTTTCACCGAGTACCCCTGATTCAAGGTTCAAGGGAGG-3’。


2.含有权利要求1所述LAMP引物的检测试剂或试剂盒。


3.蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述LAMP引物，还包含dNTPs、BstDNA聚合酶、反应缓冲液、标准阳性模板中的至少—种。


4.权利要求1所述LAMP引物、权利要求2所述检测试剂或试剂盒，或权利要求3所述检测试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)中的应用。


5.蓝莓茎溃疡病病菌(Neofusicoccumalgeriense)检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物进行LAMP扩增反应；
3)扩增结果判定。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：张英，王宇，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11