一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过基因敲除提高5‑甲基四氢叶酸含量的方法。通过CRISPR/Cas9技术对玉米

A method of increasing the content of 5-methyltetrahydrofolate by gene knockout

【技术实现步骤摘要】
一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法
本专利技术属于基因工程及分子生物学
，具体涉及一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法。
技术介绍
在生物体中叶酸是一碳单位的供体和受体，参与嘌呤、甲酰甲硫氨酸-tRNA、胸苷酸、甘氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸的生物合成，以及DNA和蛋白质的甲基化等功能。它属于水溶性的B族维生素，是四氢叶酸及其衍生物的统称，包括四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸等衍生形式。由于人类和其他动物不能自身合成叶酸，膳食摄取成为人类获取叶酸的主要来源。叶酸摄入不足会造成许多严重的健康问题，可以直接导致巨幼红细胞性贫血和高同型半胱氨酸原发性高血压，并增加患癌症、心血管疾病、老年痴呆症、冠状动脉硬化等多种疾病的风险。5-甲基四氢叶酸作为主要的叶酸活性形式之一，是人体血清中叶酸的主要存在形式，能够直接被人体吸收利用从而降低血液中同型半胱氨酸的水平，对于高血压和贫血等疾病都具有显著改善效果。目前一些国家和地区通常采用叶酸片补充等措施来改善叶酸缺乏的状况，但过量摄入人工合成叶酸会导致人体DNA甲基化水平和模式发生改变，加速结肠癌和前列腺癌的发展和癌前期病变的发生，还会掩盖维生素B12的缺乏。同时还有一部分人群中编码叶酸代谢基因亚甲基四氢叶酸还原酶的基因存在天然变异，使得他们难以将摄入的叶酸转化为具有活性的5-甲基四氢叶酸。这些都使得一些国家和地区叶酸缺乏的情况仍难以在短期内得以改善。由于植物中合成的叶酸主要是具有生物活性的叶酸形式，因此提高植物性膳食中的叶酸水平对改善我国人群叶酸缺乏状况与预防和减少相关慢性病的发生具有重要作用，对建设“健康中国”、实现我国经济和社会的可持续发展具有极其重要的现实意义。基因组编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良强有力的手段之一。其中，CRISPR/Cas9是一种用于靶标基因特定DNA修饰的工具，因其高效、便捷、适用范围广而成为当今最热门的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统主要由引导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白结构域组成，在识别、切割目标DNA双链后，通过同源重组或非同源末端连接修复途径产生DNA突变。该技术不仅可研究、鉴定和筛选与重要性状相关的基因，还能更准确快速地设计、改造作物品种，同时可有针对性地聚合多个优良性状，以提高植物的抗性、产量或品质。通过基因编辑的手段提高植物叶酸含量已成为目前生物强化的主要手段之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供通过一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术利用基因编辑技术，对玉米中编码谷氨酸亚胺甲基转移酶1的基因ZmGFT1（该基因所在位点的编号为GRMZM2G124863，参考玉米基因组B72RefGen_v2）进行敲除突变，背景材料来源于自交系C01，扩增CDS序列引物对为Primer1(SEQIDNO.5)/Primer2(SEQIDNO.6)，其CDS序列为SEQIDNO.1，编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2，具体优选的敲除突变靶位点为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。所述5-甲基四氢叶酸包括单谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸、二谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸、三谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸。所述的通过基因敲除提高玉米5-甲基四氢叶酸含量的方法步骤如下：（1）突变靶点：在ZmGFT1外显子对应的基因组区域选择2个靶位点，这2个靶位点具有共同的特征：3’端具有NGG（N为A，T，C，G任一碱基）。（2）构建包含以上2个靶位点的CRISPR/Cas9载体，即重组质粒ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9-GFT1。（方法可参照LiCX,LiuCLetal.,2017,PlantBiotechnologyJournal,15:1566-1576）。（3）该CRISP/Cas9载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中得到重组菌株ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9（Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition）。（4）将重组菌株ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9采用农杆菌介导方法转化玉米自交系（品种C01），获得基因敲除的转基因T0代植株。（5）T0代植株中筛选出能够稳定遗传的已发生基因突变但不含有重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9-GFT1的转基因阴性植株。（6）通过高效液相色谱仪器（液相色谱仪的型号为：Thermo-QuantumDiscover。色谱柱型号为：Kromasil100-5C18。）对基因敲除的转基因玉米植株进行叶酸检测，检测叶酸形式为单谷氨酸5-甲基四氢叶酸，二谷氨酸5-甲基四氢叶酸，三谷氨酸5-甲基四氢叶酸，检测器官包括种植70天的新鲜叶片和授粉后25天的新鲜籽粒。上述构建的CRISPR/Cas9敲除载体或含有所述敲除载体的重组菌也应属于本专利技术的保护范围。另外，用于构建所述CRISPR/Cas9敲除载体的引物也应在本专利技术保护范围之内，包括引物Primer3(SEQIDNO.7)和Primer4(SEQIDNO.8)。在方法中基因相关的其他引物也应在本专利技术保护范围之内，包括用于扩增自交系C01中ZmGFT1基因CDS序列引物对Primer1(SEQIDNO.5)和Primer2(SEQIDNO.6)、用于检测转基因植株靶位点是否突变的扩增引物对Primer7(SEQIDNO.11)和Primer8(SEQIDNO.12)、用于植株转录水平检测的qRT-PCR扩增引物对Primer9(SEQIDNO.13)和Primer10(SEQIDNO.14)。本专利技术的有益效果：本专利技术利用CRISPR/Cas9技术对玉米中编码谷氨酸亚胺甲基转移酶1的基因ZmGFT1进行基因编辑，并且发现了该基因的敲除显著提高了玉米中5-甲基四氢叶酸的含量。玉米ZmGFT1基因编码的谷氨酸亚胺甲基转移酶能够以5-甲基四氢叶酸为底物，生成其他叶酸衍生物。这不仅为在玉米和其他作物中研究叶酸代谢提供了理论基础，还可以通过基因工程手段，提高转基因植物的叶酸含量，缓解人类在叶酸营养方面的隐形饥饿问题。附图说明图1中A为本专利技术实施例1中野生型玉米自交系C01的ZmGFT1基因CDS序列PCR扩增结果；图1中B为本专利技术在ZmGFT1基因外显子上设计的2个CRISPR/Cas9敲除靶位点的位置（T1和T2）。图2为本专利技术实施例1中对ZmGFT1转基因植株材料的Bar基因PCR扩增部分结果；其中36-1、36-2、36-3、36-4、36-6为阳性转基因植株，36-5，36-7，36-8为转基因阴性植株。图3为本专利技术实施例1中野生型C01和基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法，其特征在于，所述方法是对玉米

【技术特征摘要】
1.一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法，其特征在于，所述方法是对玉米ZmGFT1基因进行敲除突变，获得5-甲基四氢叶酸含量提高的玉米植株。


2.根据权利要求1所述通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法，其特征在于，所述5-甲基四氢叶酸包括单谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸、二谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸、三谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸。


3.根据权利要求1所述通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法，其特征在于，构建含有玉米ZmGFT1基因靶标序列的重组基因CRISPR/Cas9敲除载体，转化野生型玉米自交系，对玉米的基因ZmGFT1进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜凌，张春义，连通，梁秋菊，王维轩，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11