本发明专利技术公开了凡纳滨对虾肌内质网Ca
【技术实现步骤摘要】
凡纳滨对虾肌内质网Ca-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白与应用。
技术介绍
肌内质网Ca2+-ATP酶(Sarco/endoplasmicreticulumCa2+-ATPase,SERCA)SERCA位于肌肉细胞的肌质膜网上。其功能主要是在肌肉的舒张时，消耗ATP水解的能量将胞浆中的钙离子运送到肌质膜的管腔中。SERCA在调控胞浆Ca2+浓度以及维持内质网官腔内的Ca2+浓度中起着关键的作用。在水生动物中，研究得较多的是SERCA，目前已经得到基因克隆的生物包括马氏珠母贝(Pinctadafucata)、紫色球海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)、玻璃海鞘(Cionaintestinalis)、青枪鱼(Makairanigricans)、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)、乌鳢(Panulirusargus)以及凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)。凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是全球第一大养殖对虾，是我国对虾养殖的主导品种。因其繁殖期长；广盐性；广温性；可以密养产量高；抗病力较强；耐干性较强；肉质鲜美；个体较大等优点成为养殖最多的品种。近年来凡纳滨对虾已经成为全球第一大养殖对虾，并且也是我国对虾养殖的主导品种。2011年凡纳滨对虾养殖产量约124万吨，占对虾总产量的85％。2011年我国虾类产品的生产总量156万吨，虾类出口30万吨，出口值近21.9亿美元，成为水产品中出口值最高的产品。凡纳滨对虾是广盐性的水产养殖品种,这与该对虾体内存在复杂的离子调节机制有关。肌内质网Ca2+-ATP酶是一种细胞内膜结合酶，在凡纳滨对虾的盐度胁迫中表达，我们之前的研究集中在基因水平，分析了LvSERCA的时序表达，然而对于LvSERCA的基因表达和功能研究还未有报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因及其编码蛋白。本专利技术的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第115位-3123位碱基所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。本专利技术的第二个目的是提供一种含有凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因的重组表达载体。优选，所述的重组表达载体的表达载体为pET-32a。本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。优选，所述的宿主细胞为大肠杆菌JM109。本专利技术的第四个目的是提供上述的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因作为筛选盐度抗性家系的分子标记在辅助育种中的应用。所述的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因在提高盐耐受性中的应用。凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白或其编码基因在提高凡纳滨对虾或大肠杆菌的盐耐受性中的应用。本专利技术通过试验证明，转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21对盐度具有的一定的耐受性，进一步证明了凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因具有明显的盐度耐受功能，凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因或其编码蛋白可作为筛选盐度抗性家系的分子标记，用于辅助育种选择。附图说明图1是提取的凡纳滨对虾总RNA，其中M为λ-HindⅢ，1为凡纳滨对虾总RNA。图2是LvSERCA基因的扩增，其中M为λ-HindⅢ，1为LvSERCA基因。图3是pET-32a酶切产物电泳，其中M为λ-HindⅢdigest，1为pET32a-BamHI/SalI。图4是重组载体pET-32a-LvSERCA转化大肠杆菌后的菌落PCR检测电泳图，其中M为DL2000的Marker，1、2为阳性菌落PCR扩增产物。图5是原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA诱导表达的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白Marker，1为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a全细胞，2为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a上清，3为经IPTG诱导的原核表达载体pET-32a全沉淀，4为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA，5为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA上清，6为经IPTG诱导的原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA沉淀。图6是盐度耐受检测图，图中的pET-32a-LvSERCA代表转化有原核重组表达载体pET-32a-LvSERCA的大肠杆菌BL21，pET-32a代表转化有空原核表达载体pET-32a的大肠杆菌BL21。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所涉及的材料及来源如下：大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌JM109感受态细胞、原核表达载体pET-32a、大肠杆菌BL21均购自天根生化科技有限公司。实施例1：凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶基因LvSERCA的克隆及测序1、引物的设计以凡纳滨对虾腮组织的cDNA为模板，PCR扩增endoplasmicreticulumCa2+-ATPaseLvSERCA基因CDS区3009bp(GeneAccessionNo.：JN986572)，(LvSERCA-F：5'-GGCTGATATCGGATCCATGGAGGACGGACACTGTTACGAGTTCG-3'，LvSERCA-R：5'-CCGCAAGCTTGTCGACTTACCATTTTTGCTCAATCTTGCCAGG-3')。测序引物(P1：5'-ATTTGCGGTCACGGGAGAAT-3'，P2：5'-TCGACACGGGAGAAGAGACG-3'，P3：5'-GCCAACATAGCCACCAATAG-3'，R1：5'-CAAGGGCAAGGCAAGTGGTGATGA-3'，T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')2、RNA的提取以凡纳滨对虾腮组织为材料，使用Trizol法提取总凡纳滨对虾的总RNA，具体操作如下：在液氮冷冻下，将0.1g左右凡纳滨对虾腮组织研磨成粉末，加入1mLTrizol提取液(购自Invitrogen公司，货号为15596-026)，室温静置5min，使其充分裂解，再加入氯仿，充分混匀15分钟，于室温放置15min，4℃12000g离心1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种凡纳滨对虾肌内质网Ca
【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的凡纳滨对虾肌内质网Ca2+-ATP酶LvSERCA基因编码蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在，其核苷酸序列如SEQIDNO.1的第115位-3123位碱基所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的基因。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体的表达载体为pET-32a。
6.一种宿主细胞，其特征在于，含...
【专利技术属性】
技术研发人员：王艳红，胡超群，陈廷，任春华，罗鹏，黄文，江晓，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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