猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法。该二价灭活疫苗包括目前流行的两种猪流行性腹泻变异毒株2a和2b亚型，可以预防由这两种不同变异株引起的腹泻，一针两用、安全有效，减少了动物的免疫和应激次数，可以通过免疫母猪保护小猪。制备方法包括：猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b全悬浮无血清培养，将灭活后的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b病毒液按比例混合，再加入佐剂充分乳化即得。本发明专利技术采用全悬浮无血清ST细胞培养工艺制备所得病毒液抗原含量高、易于放大培养、批量大、批间差异小，该工艺降低了污染风险、成本低，为PEDV的防控提供有效手段。

Bivalent inactivated vaccine of porcine epidemic diarrhea virus variant 2a and 2b and its preparation

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物技术和预防兽医领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪腹泻疾病包括细菌引起的腹泻和病毒引起的腹泻，而在病毒性腹泻中起到主要防疫作用的是猪流行性腹泻病毒。目前市面可见的猪腹泻疫苗大多为猪流行性腹泻病毒灭活苗或者活苗、猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎或其它病毒的二联苗及猪流行性腹泻病毒-猪传染性胃肠炎病毒-猪轮状病毒等其它病毒的三联苗。然而，这些单苗或联苗对于现在流行的2a亚型或2b亚型变异株无效。另外，目前疫苗生产中血清问题日益突出，价格高、对猪有副反应等问题推动着无血清病毒培养技术的快速发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒2aKQ01株，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCCNO:V202005，保藏日期2019年12月19日。第二方面，本专利技术提供猪流行性腹泻病毒2bKQ02株，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCCNO:V202006，保藏日期2019年12月19日。第三方面，本专利技术提供所述猪流行性腹泻病毒2aKQ01株和/或所述猪流行性腹泻病毒2bKQ02株在疫苗制备中的应用。第四方面，本专利技术提供一种组合物，其包含所述猪流行性腹泻病毒2aKQ01株和/或所述猪流行性腹泻病毒2bKQ02株以及药学上可接受的载体。第五方面，本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、2b二价灭活疫苗，所述二联灭活疫苗是将猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、猪流行性腹泻病毒2bKQ02株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。其中，收获的猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、2bKQ02株的病毒液滴度不低于107TCID50/0.1mL。优选地，两种病毒液灭活后按等体积混合。可选地，所述佐剂为IMS1313。第六方面，本专利技术提供所述二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、2bKQ02株分别接种培养好的ST细胞，继续培养，22～26小时(优选22小时左右)分别收获病毒，加入甲醛灭活病毒；2)灭活后的两种病毒按比例混合后，加入佐剂混匀。细胞培养条件为：37℃，pH7.2～7.4，DO值40％～60％，转速65～150rpm。在摇床上的转速可以是150rpm，反应器上可以是65～75rpm。本专利技术中，用于悬浮培养ST细胞的培养基(ST无血清培养基)购自甘肃健顺生物科技有限公司，货号CatalogNo.:10604-17023。对于猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、2bKQ02株，最佳接毒细胞密度为2×106cells/ml，最佳接毒量为1％。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术提供的二价灭活疫苗包括目前流行的两种猪流行性腹泻变异毒株2a和2b亚型，可以预防由这两种不同变异株引起的腹泻，一针两用、安全有效，减少了动物的免疫和应激次数，可以通过免疫母猪保护小猪。制备方法包括：猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b全悬浮无血清培养，将灭活后的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b病毒液按比例混合，再加入佐剂充分乳化即为猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗。本专利技术采用全悬浮无血清ST细胞培养工艺制备所得病毒液抗原含量高、易于放大培养、批量大、批间差异小，该工艺降低了污染风险、成本低。本专利技术为PEDV的防控提供有效手段。具体优点如下：(一)本专利技术提供的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗可起到一针两用的效果，减少猪的副反应，可以通过免疫母猪保护小猪。(二)本专利技术增殖病毒采用的是无血清全悬浮培养，可以减少生产成本、减少血清带来的副反应、易于扩大生产。(三)本专利技术采用的ST细胞增殖病毒的工艺得到的病毒效价比传统工艺增殖的病毒效价至少高1个滴度，可达107.0TCID50/0.1ml。附图说明图1显示为正常悬浮的ST细胞。具体实施方式本专利技术提供一种更有效预防目前流行的由猪流行性腹泻变异株2a和2b引起的猪腹泻的猪流行性腹泻变异株2a、2b二价灭活苗及其全悬浮无血清制备方法。所述方法包括：复苏ST纯悬浮细胞后，转移至生物反应器中扩大培养，按一定比例分别接种猪流行性腹泻病毒变异株2a和猪流行性腹泻病毒变异株2b，收获后的病毒液灭活，将灭活后的病毒液按比例混合得到抗原，加入水佐剂充分乳化后即为猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b病毒液的制备1.毒种繁殖将全悬浮ST细胞以0.5×106-1×106个/ml的密度接种于摇瓶中，于37℃、5％CO2、150rpm培养箱中培养，72h后用ST无血清培养基将细胞密度稀释至2×106-3×106个/ml，加入胰酶终浓度为10ug/ml，按1％的培养体积接种猪流行性腹泻病毒变异株2a或2b，37℃继续培养，18h-24h收获病毒液，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装、冻干，于-80℃以下保存。2.生产用毒种的繁殖包括细胞的扩大培养，病毒接种，病毒液收获，病毒效价测定，无菌及外源检测。①种子罐中的细胞扩大培养：待摇瓶中全悬浮ST细胞密度达到7×106-10×106个/ml且细胞活率为95％以上时，将细胞转接于种子罐中。转接细胞前，对种子罐的溶氧(DO)电极、PH电极、温度电极要进行校准，罐体进行高压灭菌。根据种子罐体积泵入总体积20％的ST无血清培养基，以0.5×106-1×106个/ml的密度接入全悬浮ST细胞，设置最佳培养条件为37℃，pH7.2-7.4，DO40％-60％，70rpm±5rpm。②病毒接种：当生物反应器中ST细胞密度达到7×106-10×106个/ml，用ST无血清培养基将细胞密度稀释至2×106-3×106个/ml，加入的胰酶终浓度为10-15ug/ml，将步骤1的病毒液作为种毒，按0.5％-1％的培养体积接种猪流行性腹泻病毒变异株2a或2b，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，pH7.2-7.4，DO40％-60％，70rpm±5rpm。③病毒液收获：接毒后18-24h收获并取样检测其TCID50，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装。④病毒含量测定及无菌、外源检验：按现行《中国兽药典》附录进行病毒效价测定及检验，病毒含量均不低于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪流行性腹泻病毒2a KQ01株，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:V202005。/n

【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻病毒2aKQ01株，其特征在于，保藏号为CCTCCNO:V202005。


2.猪流行性腹泻病毒2bKQ02株，其特征在于，保藏号为CCTCCNO:V202006。


3.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒2aKQ01株和/或权利要求2所述猪流行性腹泻病毒变异株2b在疫苗制备中的应用。


4.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述猪流行性腹泻病毒2aKQ01株和/或权利要求2所述猪流行性腹泻病毒变异株2b以及药学上可接受的载体。


5.猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、2b二价灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗是将猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、猪流行性腹泻病毒2bKQ02株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。

【专利技术属性】
技术研发人员：张华伟，周明光，余蕾，徐高原，倪冬冬，金建云，罗修鑫，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42