高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法技术

本发明专利技术提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法，该组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和至少两种抗菌剂组成；本发明专利技术提供的组合物及方法在不灭活、无需判断污染源且保证细胞活性的基础上，可强效清除大部分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、支原体，解除细胞系污染状态并使其能够再次被利用。

【技术实现步骤摘要】
高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法
本专利技术属于细胞培养
，特别涉及一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法。
技术介绍
细胞培养是体外扩增细胞的一种常规实验技术，细胞培养成功的关键之一是控制污染，细菌、真菌、支原体都是引起培养细胞污染的微生物。目前培养的细胞一旦发生细菌、真菌或支原体污染，研究人员大多的解决方式是灭活后丢弃。重新复苏冻存细胞再培养传代。但是如果细胞是非常珍贵无法替代的，上述操作存在巨大的浪费。如何在发现污染后，成功挽救珍稀细胞系，是许多实验室遇到的难题。抗生素的联合用药由来已久，抗生素联合应用的目的是在于获得最佳协同作用，提高疗效。联合用药时应根据杀菌的机理及抑菌的快慢进行合理组合，通常繁殖期杀菌剂加静止期杀菌剂有协同作用，繁殖期杀菌剂和速效抑菌剂有拮抗作用，繁殖期杀菌剂加慢效抑菌剂无影响，静止期杀菌剂加速效抑菌剂有协同使用，速效抑菌剂加慢效抑菌剂有协同作用。在用药时应发挥协同和相加作用，避免拮抗。传统理论认为，三种或更多抗生素联合对药效的增益不明显，甚至药物之间的相互作用会导致它们丧失基本的疗效。传统清除微生物污染的方法手段相当有限。当发现污染时，微生物已进入快速增殖期，随着时间的持续，对细胞系的毒性也会随之加大。研究人员必须迅速做出决策-判定污染源及使用的抗生素方案。此时所做的决策往往是主观经验性的，所使用的抗生素组合经常为青链霉素、环丙沙星、庆大霉素、两性霉素B等抗生素中1-2种。添加抗生素后，微生物的增殖虽被一定程度的抑制，但离杀灭还有一段时间过程，期间微生物的代谢产物对培养中的细胞毒害作用仍旧持续。由于上述方法学的限制：无法准确快速判断污染的微生物种类和数量、无法准确快速判断污染的微生物对应用抗生素的敏感性、使用抗生素选择的组合方案起效时间缓慢，以致错失最佳的细胞拯救时间、清除污染的成功率低。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法。本专利技术其中一个技术方案提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，该组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和至少两种抗生素组成。利用多种抗生素的联用能有效对抗耐药细菌；整体产生的效果比单个成分效果的总和好。利用抗生素组合处理方案，最终可解除细胞系污染状态并使其能够再次被利用，并有效避免细胞资源的浪费。进一步改进的方案中，所述抗生素选自多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂、棘白菌素类抗生素或青霉素类抗生素。进一步改进的方案中，所述组合物由质量比为1-100:5-60:10-80:10-80:0.0025-5:0.01-4的喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成；优选由质量比为6:20:15:12:2:0.8的喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成。进一步改进的方案中，所述组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素组成，其中喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素的比例为1-100μg：50-200IU：0.25-25μg：50-200IU；优选为6μg：100IU：15μg：100IU。进一步改进的方案中，所述喹诺酮类抗生素选自诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、左旋氧氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、达诺沙星、莫西沙星、克林沙星、吉米沙星、加替沙星或曲伐沙星中的一种；优选莫西沙星；所述氨基糖苷类抗生素选自硫酸新霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素或阿米卡星中的一种；优选阿米卡星或链霉素；所述多肽类抗生素选自选自多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽、短杆菌肽或万古霉素中的一种；优选万古霉素；所述头孢菌素类抗生素选自头孢克肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他定、头孢哌酮、头孢他美酯、头孢米诺钠、头孢匹罗或头孢吡肟中的一种；优选头孢曲松；所述吡格类抗生素选自咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑或泊沙康唑中的一种；优选伊曲康唑；所述嘧啶类抗菌剂选自氟胞嘧啶；所述棘白菌素类抗生素选自卡泊芬净、米卡芬净或阿尼芬净中的一种；优选米卡芬净；所述青霉素类抗生素选自氨苄西林钠、阿莫西林、青霉素、羧苄西林、哌拉西林、美西林或替莫西林中的一种；优选青霉素。本专利技术所述的抗生素及其类似物、衍生药、前药、代谢物和药物活性盐，可通过微生物发酵、化学改造、化学合成或商业途径得到。本专利技术另一个技术方案提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的冻存液，该冻存液包括85％-95％无血清培养基或完全培养基、5％-15％DMSO和高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物。其中无血清培养基包括但不限于LONZA12-725FμItraCΜLTΜREM；完全培养基包括但不限于由90％的DMEM和10％的FBS组成。进一步改进的方案中，高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成；其在冻存液内的终浓度分别为：喹诺酮类抗生素1-100μg/mL，优选6μg/mL，氨基糖苷类抗生素5-60μg/mL，优选20μg/mL，多肽类抗生素10-80μg/mL，优选15μg/mL、头孢菌素类抗生素10-80μg/mL，优选12μg/mL、吡格类抗生素0.0025-5μg/mL，优选2μg/mL、嘧啶类抗菌剂0.01-4μg/mL，优选0.8μg/mL。本专利技术所提供的冻存液一方面可直接中断微生物的增殖趋势，暂停微生物对培养细胞的毒害作用。同时为抗生素的起效争取足够的时间。另一方面，本专利技术所述的冻存液含有一组具有协同增效作用的抗真菌、细菌、支原体的抗生素组合物。抗生素联合起到更佳的效果，在抗生素选择压力及时间压力下，逐步清除污染。本专利技术另一个技术方案提供一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的复苏培养液，所述复苏培养液包括100％完全培养基和高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物。进一步改进的方案中，高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素组成，其在复苏培养液内的终浓度分别为喹诺酮类抗生素1-100μg/mL，优选6μg/mL，氨基糖苷类抗生素50-200IU/mL，优选100IU/mL，棘白菌素类抗生素0.25-25μg/mL，优选：15μg/mL和青霉素类抗生素50-200IU/mL，优选100IU/mL。本专利技术所述的复苏培养液含有另外一组具有协同增效作用的抗生素组合物。可在上述冻存液清除污染微生物及抗生素后效应基础上，继续放大抗生素组合药物治疗的作用。本专利技术另一个技术方案提供一种高效清除培养过程中微生物污染的方法，该方法包括如下步骤：(1)生理盐水洗涤污染的细胞，离心；(2)弃上清，加入冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，其特征在于，所述组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和至少两种抗生素组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，其特征在于，所述组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素和至少两种抗生素组成。


2.如权利要求1所述的高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，其特征在于，所述抗生素选自多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂、棘白菌素类抗生素或青霉素类抗生素。


3.如权利要求2所述的高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，其特征在于，所述组合物由质量比为1-100:5-60:10-80:10-80:0.0025-5:0.01-4的喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成；优选由质量比为6:20:15:12:2:0.8的喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素、头孢菌素类抗生素、吡格类抗生素、嘧啶类抗菌剂组成。


4.如权利要求2所述的高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，其特征在于，所述组合物由喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素组成，其中喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、棘白菌素类抗生素和青霉素类抗生素的比例为1-100μg：50-200IU：0.25-25μg：50-200IU；优选为6μg：100IU：15μg：100IU。


5.如权利要求1-4任一项所述的高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物，其特征在于，所述喹诺酮类抗生素选自诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、左旋氧氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、达诺沙星、莫西沙星、克林沙星、吉米沙星、加替沙星或曲伐沙星中的一种；优选莫西沙星；
优选地，所述氨基糖苷类抗生素选自硫酸新霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素或阿米卡星中的一种；优选阿米卡星或链霉素；
优选地，所述多肽类抗生素选自选自多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽、短杆菌肽或万古霉素中的一种；优选万古霉素；
优选地，所述头孢菌素类抗生素选自头孢克肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他定、头孢哌酮、头孢他美酯、头孢米诺钠、头孢匹罗或头孢吡肟中的一种；优选头孢曲松；
优选地，所述吡格类抗生素选自咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑或泊沙康唑中的一种；优选伊曲康唑；
优选地，所述嘧啶类抗菌剂选自氟胞嘧啶；
优选地，所述棘白菌素类抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，苏学明，许嘉慧，谢朝岱，厉大伟，
申请(专利权)人：海南一龄医疗产业发展有限公司，李锋，苏学明，
类型：发明
国别省市：海南;46