改良的表达蛋白质的菌株制造技术

本发明专利技术提供一种改良的用于产生期望的蛋白质的宿主菌株。

Improved protein expressing strain

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改良的表达蛋白质的菌株对序列表的引用本申请包含纸质和计算机可读形式的序列表。纸质和计算机可读形式的序列表是说明书的一部分或另外并入本文以供参考。
本专利技术主要涉及一种以基本上高于亲本菌株的水平表达蛋白质的真菌菌株的开发。
技术介绍
大约30年来，在微生物中已经制备期望的异源蛋白质。尽管已经引入必要的编码序列并获得了表达，然而为了优化商业生产的过程还有很多工作要做。一个感兴趣的领域涉及菌株改良，即寻找或制造宿主微生物的菌株，例如其允许以更高的产量或更好的纯度制备蛋白质。为了增加产量，一旦已设计了良好的表达系统，可能设想增加编码序列的拷贝数，或者增加mRNA的数量或稳定性，或者改善蛋白质的折叠和/或分泌，或者降低蛋白质的降解。然而，只有针对限制因素时才能看到期望的表达增加的效果。因此，需要允许期望的蛋白质如异源蛋白质的产量增加的宿主菌株。本专利技术人已经令人惊讶地鉴定了真菌细胞中GSH1的突变导致异源蛋白质产量的增加。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中GSH1基因的产物是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1p)。该酶催化谷胱甘肽(L-γ-谷氨酰半胱氨酸甘氨酸；GSH)合成中的第一步和限速步骤。第二步由谷胱甘肽合成酶(Gsh2p)催化。谷胱甘肽是必不可少的分子，其具有许多重要作用，包括保护细胞抵抗氧化应激，作为几种生物合成途径和排毒反应中的辅助因子以及维持酵母线粒体基因组(Ayer等(2010)FreeRadicalBiology&Medicine491956-1968)。除非在含有谷胱甘肽的培养基中生长，否则删除了GSH1基因的酵母细胞对一系列应激条件(例如氧化条件和暴露于重金属)高度敏感，最终它们会停止生长(Spector等(2001)TheJournalofBiologicalChemistry276(10)7011-7016)。已知谷胱甘肽在氧化应激时也能保护细胞核(Hatem等(2014)FreeRadicalBiology&Medicine67103-114)。Biterova和Barycki(2009)(TheJournalofBiologicalChemistry284，32700-32708)分析了Ghs1(也称为谷氨酸半胱氨酸连接酶)的晶体结构，以研究谷胱甘肽生物合成的机制，并指出已经观察到人谷氨酸半胱氨酸连接酶的变体(例如R127C、P158L、H370L和P414L)。之前(PCT/US2016/068239)已经鉴定了NOT4(也称为MOT2)的突变导致宿主菌株中产生的异源蛋白质产量增加。专利技术人现已鉴定结合NOT4和GSH1突变令人惊讶地导致产量的进一步增加。Not4是一种泛素连接酶，并且是Ccr4-Not复合物的一部分。Ccr4-Not复合物在真核细胞中是保守的，并且在酵母中复合物由9个核心亚基组成：Ccr4、Caf1、Caf40、Caf130、Not1、Not2、Not3、Not4和Not5(Collart，2003，GlobalcontrolofgeneexpressioninyeastbytheCcr4–Notcomplex.Gene313:1-16；Bai等,1999,TheCCR4andCaf1proteinsoftheCcr4–NotcomplexarephysicallyandfunctionallyseparatedfromNot2,Not4,andNot5.Mol.Cell.Biol.19:6642-6651)。已提议将该复合物作为中央交换机，其可以解释来自环境的信号并协调所有基因的表达水平以经济地响应信号(Collart，2012，TheCcr4-Notcomplex.Gene492(1):42-53)。据认为Not4蛋白质(Not1、Not2、Not3、Not4)是装配RNA聚合酶II复合物所必需的，这表明其在转录调节中具有全局性的作用(Collart，1994，Not1(cdc39),Not2(cdc36),Not3,andNot4encodeaglobal-negativeregulatoroftranscriptionthatdifferentiallyaffectstata-elementutilization.Genes&Development8(5):525-537；Collart，2012，如上引用)。共晶体结构表明Not4的C-末端区域如何环绕Not1(Ccr4-Not复合物中的支架蛋白质)的HEAT-重复区域(Bhaskar，2015，ArchitectureoftheubiquitylationmoduleoftheyeastCcr4-Notcomplex.Structure23(5):921-8)。
技术实现思路
本专利技术提供一种真菌宿主细胞，其具有：a.修饰的Gsh1蛋白质或其同系物，和/或b.修饰的Gsh1蛋白质或其同系物的活性水平，和/或c.修饰的GSH1基因或其同系物，和/或d.修饰的GSH1基因或其同系物的表达水平。本专利技术还提供一种真菌宿主细胞，其还具有：e.修饰的Not4蛋白质或其同系物，和/或f.修饰的Not4蛋白质或其同系物的活性水平，和/或g.修饰的NOT4基因或其同系物，和/或h.修饰的NOT4基因或其同系物的表达水平。本专利技术还提供一种真菌宿主细胞的培养物，该真菌宿主细胞包含编码期望的蛋白质如异源蛋白质的多核苷酸序列，其特征在于该真菌宿主细胞具有降低的Gsh1蛋白质或其同系物的活性水平和/或表达水平，并且任选地还具有降低的Not4蛋白质或其同系物的活性水平和/或表达水平。本专利技术还提供一种用于从真菌宿主细胞制备期望的蛋白质如异源蛋白质的方法。本专利技术提供一种用于改变来自真菌宿主细胞的期望的蛋白质的产量的方法。本专利技术还提供一种期望的蛋白质，如异源蛋白质。白蛋白或其变体、片段、和/或融合物是优选的期望的蛋白质。本专利技术还提供一种组合物，如药物组合物，其包含期望的蛋白质。本专利技术还提供一种治疗患者的方法，其包括向患者施用有效量的组合物。本专利技术还提供一种制备具有上述各项性质的真菌宿主细胞的方法。本专利技术还提供Gsh1蛋白质或其同系物，其包含与SEQIDNO:2至少50％的同一性以及在对应于选自SEQIDNO:2的一个或更多个以下位置的位置处的突变：47、48、49、50、51、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、409、451、452、453、454和455。本专利技术还提供编码本专利技术的Gsh1变体的多核苷酸。本文所述的任何实施方式(包括仅在实施例和/或优选的实施方式部分中描述的那些)意在能够与任何其它实施方式组合，除非明确否认或组合不合适。附图说明图1是示出20个氨基酸的分类及其之间的关系的文氏图。图2示出质粒pDB5438的构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌宿主细胞，其具有修饰的：/na.Gsh1蛋白质或其同系物，和/或/nb.Gsh1蛋白质或其同系物的活性水平或表达水平，和/或/nc.GSH1基因或其同系物，和/或/nd.GSH1基因或其同系物的表达水平。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170620 EP 17176932.61.一种真菌宿主细胞，其具有修饰的：
a.Gsh1蛋白质或其同系物，和/或
b.Gsh1蛋白质或其同系物的活性水平或表达水平，和/或
c.GSH1基因或其同系物，和/或
d.GSH1基因或其同系物的表达水平。


2.根据权利要求1所述的真菌宿主细胞，其中修饰的水平是降低的水平。


3.根据权利要求1或2所述的真菌宿主细胞，其中修饰的水平是相对于参照真菌宿主细胞的水平，所述参照真菌宿主细胞例如其中Gsh1蛋白质包含SEQIDNO:2或Gsh1蛋白质由SEQIDNO:2组成的真菌宿主细胞。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的真菌宿主细胞，其具有修饰的：
a.Not4蛋白质或其同系物，和/或
b.Not4蛋白质或其同系物的活性水平或表达水平，和/或
c.NOT4基因或其同系物，和/或
d.NOT4基因或其同系物的表达水平。


5.根据权利要求4所述的真菌宿主细胞，其中修饰的水平是降低的水平。


6.根据权利要求5所述的真菌宿主细胞，其中修饰的水平是相对于参照真菌宿主细胞的水平，所述参照真菌宿主细胞例如其中Not4蛋白质包含SEQIDNO:6或Not4蛋白质由SEQIDNO:6组成的真菌宿主细胞。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主为酵母或丝状真菌。


8.根据前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其包含编码期望的蛋白质的核苷酸序列，所述期望的蛋白质例如为异源蛋白质，例如为血清蛋白质，优选为白蛋白或其变体、片段和/或融合物。


9.根据前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述Gsh1蛋白质或其同系物在对应于选自SEQIDNO:2以下位置的位置处包含突变：47、48、49、50、51、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、409、451、452、453、454和455，优选R125、D49、H409或P453。


10.根据权利要求9所述的真菌宿主细胞，其中在对应于SEQIDNO:2的位置125的位置处的突变是取代为A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，优选取代为C、D、E或G，更优选取代为G。


11.根据前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述Gsh1蛋白质包含SEQIDNO:4，或者由SEQIDNO:4组成。


12.根据前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞缺乏GSH1基因或其同系物或者Gsh1蛋白质或其同系物。


13.根据权利要求5-12中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述Not4蛋白质或其同系物在对应于选自SEQIDNO:6的以下位置的位置处包含突变：426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469或470。


14.根据权利要求13所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·J·A·芬尼斯，P·K·诺德戴德，J·M·麦克劳克兰，
申请(专利权)人：阿尔布梅迪克斯医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB