用于延长的血清半衰期的工程化抗体FC变体制造技术

在一些方面，提供了在体内施用后表现出提高的与FcRn的结合和延长的半衰期的突变体或变体Fc结构域。所述Fc结构域可包含在糖基化或无糖基化抗体中。还提供了使用所述突变体或变体Fc结构域或包含所述突变体或变体Fc结构域的多肽的方法。

Engineering antibody FC variant for extended half-life of serum

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于延长的血清半衰期的工程化抗体FC变体专利技术背景本申请要求2017年8月11日提交的美国临时专利申请号62/544,622的权益，其全部内容通过引用并入本文。1.
本专利技术总体上涉及蛋白质工程领域。更特别地，其涉及赋予与FcRn的增强的pH依赖性结合之Fc抗体结构域的改善的血清半衰期。2.
技术介绍
当前，市场上排名前25位的重组治疗性抗体的销售额远超过435亿美元/年，并且从2010年到2015年的预期年增长率为9.2％，预计到2015年将增加到627亿美元/年(Elvinetal.，2013)。单克隆抗体(mAb)构成了目前临床中重组蛋白质的大部分，在美国或欧盟有1064种产品正在进行公司赞助的临床试验，其中164种处于III期(Elvinetal.，2013)。就治疗焦点而言，mAb市场主要集中于肿瘤学和炎性疾病，并且在预测期内，这些治疗领域内的产品将继续成为关键的增长动力。作为一个整体，与小分子药物相比，基因工程化mAb通常具有更高的FDA批准成功的可能性。至少50家生物技术公司和所有主要制药公司都已制定了主动抗体发现计划。1975年，Milstein和Kohler首次报道了用于分离和生产mAb的最初方法(Kohler和Milstein1975)，并且其涉及小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，从而产生小鼠杂交瘤。治疗性鼠mAb在二十世纪八十年代初期进入临床研究；然而，由于患者的人抗小鼠抗体(HAMA)的产生而导致功效不足和快速清除的问题变得明显。这些问题以及与该技术相关的时间和成本消耗成为推动mAb生产技术发展的驱动力。聚合酶链式反应(PCR)有助于直接从经免疫动物的淋巴细胞克隆单克隆抗体基因，以及在细菌中表达抗体片段组合文库(Orlandietal.，1989)。后来的文库完全通过体外克隆技术使用具有重排的互补决定区3(CDR3)的幼稚基因(naivegene)产生(Griffths和Duncan1998；Hoogenboometal.，1998)。结果，具有期望特异性的抗体片段的分离不再依赖于相应抗原的免疫原性。这些优点促进了针对包括小分子化合物(半抗原)(Hoogenboom和Winter1992)、分子复合物(Chamesetal.，2000)、不稳定化合物(Kjaeretal.，1998)和细胞表面蛋白(Desaietal.，1998)在内的许多独特抗原的抗体片段的开发。一种用于筛选大型抗体组合文库以鉴定以期望亲和力与配体结合的克隆的方法涉及在细菌细胞并且更具体地大肠杆菌表面上表达和展示抗体片段或全长抗体。将展示抗体或抗体片段的细胞与荧光标记的配体溶液一起孵育，并通过流式细胞术分离那些凭借其表面上展示的抗体结合所述配体的细胞。特别地，锚定周质表达(AnchoredPeriplasmicExpression，APEx)是基于将抗体片段锚定在大肠杆菌内膜的周质面上，然后破坏外膜，与荧光标记的靶标一起孵育以及对原生质球进行分选(美国专利号7,094,571，Harveyetal.，2004；Harveyetal.，2006)。在人血清蛋白质中，白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)具有比人中的其他血清蛋白质更长的血清半衰期(～3周)。已知新生儿Fc受体(FcRn)发挥许多重要的生物学功能，例如再循环和胞吞转运过程，从而导致IgG在人体内约21天的极长的血清持久性(Challaetal.，2014)。IgG的这种细胞间运输可以调节其体内稳态，从而通过阻止IgG细胞内降解而导致体内降低的清除率和延长的半衰期(Oberetal.，2004；Wardetal.，2015)。在几乎所有细胞类型中，FcRn主要定位于细胞内囊泡，例如早期和再循环内体和分选小管(sortingtubule)，并且FcRn的表达水平在细胞表面上受到限制(Oberetal.，2004)。此外，IgG-FcRn相互作用在酸性pH下是最佳的，但在中性pH下损失。因此，公认的FcRn介导的IgG再循环模型是IgG通过非特异性胞饮作用内化，并且IgG在酸性内体(～pH6.0)中与FcRn结合，并被回收回到细胞表面(生理pH7.4)，以维持血液中IgG的高血清水平(Ghetieetal.，1996；Ghetie和Ward，2000；Israeletal.，1996；Kimetal.，1999；Martinetal.，2001；Roopenian和Akilesh，2007；Roopeniangtal.，2003)。但是，未在细胞表面与FcRn解离的IgG注定要进行溶酶体降解，因为其从转运回收到溶酶体，或者在受体周转(receptorturnover)期间被分解代谢(Ganetal.，2009)。由于Fc与FcRn结合的生理重要性以及Fc与具有治疗性抗体的FcRn结合的重要性，因此对通过增强对FcRn的pH依赖性结合而具有延长的血清半衰期的新Fc结构域具有明显需求。
技术实现思路
在一些方面，本专利技术通过提供对FcRn表现出增强的pH依赖性亲和力的Fc结构域变体，克服了现有技术中的限制。如以下实例中所示，提供了工程化的突变体IgGFc结构域，其在酸性pH下以远超过野生型人IgG的亲和力与FcRn结合，并且在一些方面，进一步观察到突变体Fc结构域在生理pH(生理pH7.4)下具有非常低的至可忽略不计的或不可检出的与FcRn的结合。这样的高pH选择性FcRn亲和力对于延长血清半衰期是非常理想的。在本专利技术的一些方面，提供了用于分离对FcRn表现出在酸性pH下的增强的亲和力和pH选择性的抗体Fc结构域的方法。在本专利技术的另一方面，提供了IgG1Fc结构域中的特定突变和突变的组合，其可以导致对FcRn的pH选择性结合和/或提高的亲和力。更具体地，在一些实施方案中，提供了突变体或变体人Fc结构域，与相应的野生型Fc结构域相比，其对于FcRn表现出：(i)在pH5.8下增强的结合，以及(ii)在pH7.4下降低的结合或不可检出的结合。突变体或变体Fc结构域可以是突变体或变体IgG结构域。突变体或变体Fc结构域可包含在多肽(例如抗体)中。在一些实施方案中，突变体或变体Fc结构域可包含在治疗性抗体(例如激动性或拮抗性抗体)中。在一些实施方案中，存在组合物，其包含具有来源于人IgG1-4抗体的突变体或变体Fc结构域(“抗体Fc结构域”)的多肽。突变体Fc结构域可以是野生型人IgG1Fc结构域(SEQIDNO：1)的变体，其中突变体或变体Fc结构域能够在酸性pH下以提高的亲和力与FcRn结合，但是在中性pH下不能。在一些实施方案中，工程化Fc结构域可表现出提高的对FcRn的亲和力，例如比糖基化的野生型Fc结构域高约5倍。在另一些实施方案中，提供了所有其他野生型IgG亚类(人IgG2、IgG3和IgG4)的突变体人Fc结构域，其在酸性pH下能够以提高的亲和力与FcRn结合，并且在中性pH下不能。相对于野生型人IgG1Fc(SEQIDNO：1)、人IgG2Fc(SEQIDNO：2)、人IgG3Fc(SEQIDNO：3)或人IgG4Fc(SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含能够在酸性pH下结合人FcRn的突变体或变体人IgG Fc结构域的多肽，其中所述Fc结构域具有以下替换突变：/n(i)第309位的天冬氨酸(L/V309D)；/n(ii)第311位的组氨酸(Q311H)；和/n(iii)第434位的替换突变(N434)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170811 US 62/544,6221.包含能够在酸性pH下结合人FcRn的突变体或变体人IgGFc结构域的多肽，其中所述Fc结构域具有以下替换突变：
(i)第309位的天冬氨酸(L/V309D)；
(ii)第311位的组氨酸(Q311H)；和
(iii)第434位的替换突变(N434)。


2.权利要求1所述的多肽，其中第434位的替换突变是丝氨酸(N434S)或酪氨酸(N434Y)。


3.权利要求2所述的多肽，其中第434位的替换突变是丝氨酸(N434S)。


4.权利要求2所述的多肽，其中第434位的替换突变是酪氨酸(N434Y)。


5.权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域是糖基化的。


6.权利要求5所述的多肽，其中所述Fc结构域与野生型相比具有基本上等价、基本上相同、大致相同、或相同的与FcγR的结合。


7.权利要求5所述的多肽，其中所述Fc结构域与野生型相比具有基本上等价、基本上相同、大致相同、相同或等价的与FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的1种、2种或全部的结合能力。


8.权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中在酸性pH下，所述Fc结构域以高于野生型的亲和力结合FcRn。


9.权利要求8所述的多肽，其中在中性pH下，所述Fc结构域不与FcRn可检出地或选择性地结合，或者不表现出或基本上不表现出与FcRn的结合。


10.权利要求9所述的多肽，其中与野生型相比，所述Fc结构域表现出：(i)在pH5.8下增强的与FcRn的结合，以及(ii)在pH7.4下降低的与FcRn的结合或没有可检出的与FcRn的结合。


11.权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域是无糖基化的。


12.权利要求11所述的多肽，其中所述Fc结构域在第264位具有谷氨酸替换突变(V264E)。


13.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG1。


14.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG2。


15.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG3。


16.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG4。


17.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域包含以下或由以下组成：
EDHS(SEQIDNO：5；V264E；L309D；Q311H；N434S)，
EDHY(SEQIDNO：6；V264E；L309D；Q311H；N434Y)，
DHS(SEQIDNO：7；L309D；Q311H；N434S)，
DHY(SEQIDNO：8；L309D；Q311H；N434Y)，
IgG2-DHS(SEQIDNO：9；V309D；Q311H；N434S)，
IgG3-DHS(SEQIDNO：10；L309D；Q311H；N434S)，或
IgG4-DHS(SEQIDNO：11；L309D；Q311H；N434S)。


18.权利要求17所述的多肽，其中所述Fc结构域包含以下或由以下组成：DHS(SEQIDNO：7；L309D；Q311H；N434S)或DHY(SEQIDNO：8；L309D；Q311H；N434Y)。


19.权利要求1至18中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域以小于约550nM的KD值结合FcRn。


20.权利要求19所述的多肽，其中所述Fc结构域以小于约250nM的KD值结合FcRn。


21.权利要求19所述的多肽，其中所述Fc结构域以小于约125nM的KD值结合FcRn。


22.权利要求1至21中任一项所述的多肽，其还包含非Fc受体(非FcR)结合结构域。


23.权利要求22所述的多肽，其中所述非FcR结合结构域是Ig可变结构域。


24.权利要求23所述的多肽，其中所述多肽是全长抗体。


25.权利要求24所述的多肽，其中所述抗体是激动性抗体。


26.权利要求24所述的多肽，其中所述抗体是拮抗性抗体。


27.权利要求24所述的多肽，其中所述抗体选择性结合Her2/neu、CD20、CD40、IL-10、4-1BB、PD-1、PD-L1、CTLA-4OX...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治·乔治乌，李昌翰，姜泰贤，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US