多糖结合疫苗中残余氰基硼氢化钠的离子色谱检测方法技术

氰基硼氢化钠（NaCNBH

Determination of residual sodium cyanide borohydride in polysaccharide conjugated vaccine by Ion Chromatography

【技术实现步骤摘要】
多糖结合疫苗中残余氰基硼氢化钠的离子色谱检测方法
本专利技术属于测试分析领域，具体为一种利用离子色谱-脉冲安培测定NaCNBH3的方法。
技术介绍
多糖结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，抗原类型从胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，能激发2岁以下儿童、老年人和免疫缺陷者体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆，诱导产生的保护性抗体主要为IgG抗体，比多糖疫苗诱导产生的IgM更有效，且能维持较长时间，具有多糖疫苗不可比拟的优势。在多糖结合疫苗的制备工艺中，荚膜多糖经高碘酸钠氧化形成的醛基与蛋白的氨基形成C=N双键，在催化剂氰基硼氢化钠的条件下，C=N双键被还原成稳定单键，从而促进了结合反应的右移。因此，氰基硼氢化钠（NaCNBH3）被广泛的应用在多糖结合疫苗的制造领域。由于该物质含有氰基，具有一定的毒性，故需要对结合疫苗中残余NaCNBH3进行有效监控，准确测定多糖结合原液疫苗中NaCNBH3的残留量对疫苗产品质量控制具有重要意义。目前，国内采用紫外可见分光光度法（UV）和酶标法，来测定花粉蛋白注射液NaCNBH3的含量，此法反应时间长（5h），条件复杂，灵敏度低，且目前国内无相关文献报道多糖结合疫苗中NaCNBH3残留量的测定方法，因此如何对多糖结合疫苗中痕量NaCNBH3残留进行准确测定仍是一个技术难点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多糖结合疫苗中残余NaCNBH3离子色谱-脉冲安培的检测方法。通过该方法，可准确、快速实现多糖结合疫苗中0.05umol残余NaCNBH3的有效监控。本专利技术所述的多糖结合疫苗中残余NaCNBH3离子色谱-脉冲安培测定方法，包括如下步骤：(1)用NaCNBH3标准品配制不同浓度的对照品溶液；(2)待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；(3)供试品溶液和对照品溶液NaCNBH3分别上样于离子色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；(4)以对照NaCNBH3溶液的系列浓度对其相应的色谱峰面积作直线回归，然后将供试品溶液的NaCNBH3色谱峰面积代入直线回归方程，求出其相应浓度。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的多糖结合疫苗中残余NaCNBH3的离子色谱-脉冲安培检测方法，在试样处理中，用30KD的超滤管4000g离心20分钟排除了细菌多糖对NaCNBH3测定的干扰，试样中NaCNBH3能得到良好分离和准确定量。两组加标样品中NaCNBH3的回收率分别为94.1%~101.6%。本专利技术方法简单、操作方便、精确度高，为试样中NaCNBH3的测定提供了良好的条件，可以用于流脑、HIB及肺炎等多种多糖结合疫苗中NaCNBH3残余的测定。附图说明图1为专属性测定结果；图2为线性测定结果。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步描述，但不应用来限制本专利技术的范围。实施例1b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液中NaCNBH3残余的测定：1.精密制取0.5umol/L、1.0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/LNaCNBH3标准溶液2.b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液用30KD的超滤管4000g离心20分钟,收取滤过液，稀释10倍后用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；3.标准溶液、供试品溶液分别按照色谱条件进行上样检测；色谱条件的设定：3.1流动相：50mmol/LNaOH溶液；3.2色谱柱：AG11–HC,AS11–HC柱，购自thermo公司；3.3检测器：脉冲安培检测器，参比电极为氯化银，检测波形“银电极，S-2,CN-”；3.4检测方法：色谱峰面积外标定量法；3.5进样体积：25μl，3.6色谱柱温度：30℃；3.7流速：1ml/min。4.结果根据测定值，计算曲线方程：Y=0.037X+0.0035其中Y为峰面积，X为浓度；供试品中氰基硼氢化钠峰面积为0.042，计算供试品中氰基硼氢化钠浓度为10.4umol/L10.4umol/L远远小于标准0.05mmol/L本专利技术方法的方法学验证：专属性验证：由于在制备结合物过程中主要涉及以下化学物质，因此在进行方法专属性研究时分别用10μmol/L浓度的NaCNBH3标准品、水空白、10mg/L碳酸氢钠、10mg/L碳酸钠、10mg/L磷酸氢二钠、10mg/L磷酸二氢钠、按照实施例1中的方法进行检测，测试结果见附图1：10μmol/L浓度的NaCNBH3在3.93min明显单峰（见图1），而碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠在此位置未出现任何吸收峰，因此说明该方法对NaCNBH3进行检测专属性良好。检测限、定量限验证：分别配制0.01umol/L、0.05umol/L、0.25umol/L低浓度的NaCNBH3标准样品，按照实施例1中方法进行进样检测，结果如表1所示：当NaCNBH3浓度为0.01umol/L时S/N=4.7，满足信噪比至少为3:1，初步确定0.01umol/L为NaCNBH3检测的检测限；当NaCNBH3浓度为0.05umol/L时，信噪比约为14.2:1，确定0.05umol/L为NaCNBH3检测的定量限。线性验证：分别配制0.5umol/L、1.0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/L5个浓度的NaCNBH3对照品溶液，按照实施例1中方法进行进样检测，实验结果如表1所示：各个样品在3.93分左右均出现洗脱峰，线性回归方程为Y=0.037X+0.0035，R=0.9999（n=5），线性成立。精密度验证：取b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液试样，按照实施例1的方法平行测定测定6次NaCNBH3的含量，计算精密度。测试结果如下表3所示：相对标准偏差为1.13%，说明精密度良好。回收率测定：在b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液样品中分别添加10umol/L和20umol/L的NaCNBH3标准品各三份，按照实施例1的方法测定试样中NaCNBH3的含量。测定量与加入量相比为NaCNBH3的回收率。测定结果如下表4所示：两组加标样品回收率均在94.1%~101.6%之间，测定结果显示了该方法用于测定多糖结合物中NaCNBH3P残留量具有良好的准确度。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多糖结合疫苗中残余NaCNBH

【技术特征摘要】
1.多糖结合疫苗中残余NaCNBH3离子色谱测定方法，其特征在于包括如下步骤：
用NaCNBH3配制对照品溶液；
待检样品用超滤离心管进行离心,收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；
供试品溶液和对照品溶液NaCNBH3分别上样于离子色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；
根据对照品溶液NaCNBH3浓度及其色谱峰面积，供试品溶液NaCNBH3色谱峰面积，采用外标法计算试样中NaCNBH3的浓度。


2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的待检样品为多糖结合物原液。


3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙述学，刘晓磊，何新宇，
申请(专利权)人：北京成大天和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11