一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：核酸提取；高通量测序文库构建；将高通量测序文库构建中构建的测序文库进行定量；将定量后的测序文库，稀释至1‑4pM，在测序仪上进行高通量测序；对高通量测序中获得的测序数据进行分析。本发明专利技术的另一方面，还提供了一种病原微生物检测试剂盒，本发明专利技术所提供的基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法及试剂盒，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。

A detection method and kit of pathogenic microorganism based on macrogenomics

【技术实现步骤摘要】
一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒
：本专利技术涉及生物
，具体的，涉及一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒。
技术介绍
：感染性疾病是由病原微生物(细菌、病毒、真菌、寄生虫等)引起的疾病的统称。据统计，感染性疾病死因占全部死因的25％以上，是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。全球每年罹患感染性疾病的患者大约有4000万，我国患者约占四分之一，其中临床诊断病因不明占近百分之五十(约500万)。当不明原因的感染性疾病发生时,快速准确的鉴定病原体是精准治疗、有效监测、控制疾病蔓延和降低医疗负担的关键。基于高通量测序的宏基因组技术不依赖传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够尽可能地获取样本中包含的所有核酸序列信息，然后与数据库进行比对分析，根据比对得到的序列信息来判断样本中所含微生物的种属信息，在病原体检测中发挥着重要的作用。高通量测序用于感染性疾病的诊断首次报道于2014年1例中枢神经系统感染患者。此外，在呼吸道感染中，高通量测序也用于包括痰液、肺泡灌洗液等多种呼吸道标本，并表现出良好的检测性能。血液样本也是高通量测序的重要应用领域，在血流感染的病原检测中也发挥着作用。但是目前基于高通量测序技术进行病原微生物检测的技术一般采用传统的基于Illumina测序平台的文库构建方法，包括超声打断、DNA片段末端修复、接头连接和PCR扩增等多个步骤，实验操作复杂，且依赖特定的机械设备如Covaris打断仪，价格成本高且耗时长。有鉴于此，提出本专利技术。r>
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法、病原微生物检测方法及试剂盒，以解决现有技术中的至少一项技术问题。具体的，本专利技术的第一方面，提供了一种基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法，所述方法包括如下步骤：S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；S103，对S102中的产物进行纯化，获得高通量测序文库。采用上述技术方案，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。优选地，步骤S101中，其反应体系包括：按体积份数计，DNA样本X份，片段化缓冲液1-2份，片段化酶2-4份，BufferEB将体系补足至15份，其中，所述DNA样本浓度为5-30ng/μl，反应条件为：优选地，所述反应体系还包括0.5-1份的增强剂(Enhance)。优选地，所述反应体系中，按体积份数计，片段化缓冲液1.5份，片段化酶3份，Enhance0.75份，BufferEB将体系补足至15份。优选地，步骤S101中，所述片段化酶反应体系还包括聚乙二醇2000，按体积份数计，所述聚乙二醇2000的含量为0.1-0.3份。更优选地，所述片段化酶反应体系中还包括0.02-0.04份的聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)。在体系中有聚乙二醇存在的情况下，加入微量的PVP-K30，能进一步提高片段的均一性。优选地，步骤S101中，所述片段化酶为DNAFrafmentationLigase。优选地，步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：末端修复产物10-20份，连接缓冲液5-8份，连接酶2-5份，index接头4-6份，BufferEB0.5-2份，其中，连接酶浓度为500-800U/μl，反应条件为，优选地，步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：末端修复产物15份，连接缓冲液6份，连接酶3份，index接头5份，BufferEB1份，其中，连接酶浓度为600U/μl。优选地，所述连接缓冲液包括，300-350mMTris-HCl，30-60mMMgCl2，3-6mMDTT，3-6mMATP。更优选地，所述连接缓冲液包括330mMTris-HCl，50mMMgCl2，5mMDTT，5mMATP。优选地，步骤S103中，对步骤S102中的产物通过磁珠进行纯化。优选地，所述通过磁珠进行纯化的步骤包括：S201，吸取10-30μLEBBuffer和30-50μLDNACleanBeads至20-40μL接头连接反应产物中，充分混匀；S202，室温孵育1-10min；S203，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；S204，继续在外部磁场的作用下，加入100-300μL的70-90％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育10-60s，移除上清；S205，将所述磁珠暴露在空气中干燥5-10min，S206，将磁珠加入10-30μLEB洗脱，充分混匀，室温下静置1-10min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取10-20μl上清液，即为纯化产物。优选地，重复所述S204步骤。优选地，所述外部磁场为磁力架，所述磁力架上设置有与试管相匹配的试管固定部。优选地，所述磁珠直径为0.5-1.5μm。更优选地，所述磁珠选用DNACleanBeads(VazymeN411)。优选地，所述S204中，所述乙醇溶液中，含有0.02-0.05mol/L的氯化钾。进一步的，本专利技术的第二方面，提供了一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法，所述方法包括如下步骤：核酸提取；高通量测序文库构建，采用如上所述的高通量测序文库构建方法；测序文库定量：将高通量测序文库构建步骤中构建的测序文库进行定量；高通量测序：将测序文库定量步骤中定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；结果分析：对高通量测序中获得的测序数据进行分析。优选地，所述结果分析步骤中的分析方法包括步骤：S401，将样本测序数据进行拆分，S402，计算数据中的宿主序列比例，S403，去除宿主序列，S404，将剩余序列与病原数据库进行比对，获得含有的病原微生物物种信息。优选地，所述拆分方法为，每一个文库两端所连接的接头上都有一个特异的Index序列，数据下机后，会根据每一条序列上测得的Index序列将不同的reads分配至不同的文库下。优选地，所述Index序列长度为8nt。优选地，上机测序时，20个文库同时上机。优选地，所述S404中，与病原数据库进行比对的方法为，S501,生成数据库哈希索引，基于特定序列长度s对数据库包含的碱基序列进行拆分，以碱基序列作为哈希索引，存储碱基序列所在基因组位置列表信息；S502,序列局部比对，将查询序列拆分为同样长度的碱基片段，通过哈希碰撞在哈希索引中查找对应序列，并获取该片段在基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法，所述方法包括如下步骤：/n核酸提取；/n高通量测序文库构建；/n测序文库定量：将高通量测序文库构建步骤中构建的测序文库进行定量；/n高通量测序：将测序文库定量步骤中定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；/n结果分析：对高通量测序中获得的测序数据进行分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法，所述方法包括如下步骤：
核酸提取；
高通量测序文库构建；
测序文库定量：将高通量测序文库构建步骤中构建的测序文库进行定量；
高通量测序：将测序文库定量步骤中定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；
结果分析：对高通量测序中获得的测序数据进行分析。


2.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述高通量测序文库构建方法包括步骤：
S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；
S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；
S103，对S102中的产物进行纯化，获得高通量测序文库。


3.根据权利要求2所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤S101中，其反应体系包括：按体积份数计，DNA样本X份，片段化缓冲液1-2份，片段化酶2-4份，BufferEB将体系补足至15份，其中，所述DNA样本浓度为5-30ng/μl，
反应条件为：

。


4.根据权利要求3所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：步骤S101中，所述片段化酶反应体系还包括聚乙二醇2000，按体积份数计，所述聚乙二醇2000的含量为0.1-0.3份。


5.根据权利要求4所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：
末端修复产物10-20份，连接缓冲液5-8份，连接酶2-5份，index接头4-6份，BufferEB0.5-2份，其中，所述连接酶浓度为500-800U/μl，
反应条件为，

。


6.根据权利要求1-5任一种所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：步骤S103中，对步骤S102中的产物通过磁珠进行纯化，所述通过磁珠进行纯化的步骤包括：
S201，吸取10-30μLEBB...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁永，王棪，李立锋，任若通，蒋智，
申请(专利权)人：天津金匙医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12