一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用制造技术

技术编号：23838301 阅读：57 留言：0更新日期：2020-04-18 03:31

本发明专利技术公开了一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用，其中所述纤维素酶以如下步骤制得：(1)工程菌株的构建；(2)液体发酵生产纤维素酶。本发明专利技术的纤维素酶在水解纤维素过程中，由于强化了对纤维素无定型区降解的酶组分和解聚大尺寸纤维素结晶区氢键的蛋白组分，促进了纤维素大分子链的断裂和纤维素结晶区的“剥皮”反应，因而应用本发明专利技术的纤维素酶更容易形成纳米尺度的纤维素晶体。与已有商业纤维素酶相比，本发明专利技术的纤维素酶的酶系组成更适合于纤维素纳米晶体的制备，且具有酶系可控、水解效率高、用酶成本低、制备过程简单、不需要对原料进行机械处理、纳米纤维素得率高等优点。

Cellulase suitable for preparing cellulose nanocrystals and its application

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【技术实现步骤摘要】
一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用
本专利技术涉及一种纤维素酶及其应用，尤其涉及一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用，属于生物

技术介绍
纤维素纳米晶体因其具有可再生、无毒、高比表面积、优异的力学性能，以及羟基易官能化等特点，近年来引起了人们的广泛关注。纤维素纳米晶体具有开发各种产品的潜力，有望取代传统的石化和不可生物降解的高分子材料，包括食品包装、薄膜和具有抗菌性能的纳米纤维素载银剂等。纤维素纳米晶体的制备方法包括浓酸水解和生物法。其中利用浓硫酸水解是目前最常用的制备方法，但该化学制备过程涉及许多问题，如使用的化学品回收困难、反应条件苛刻、最终产品由于具有毒性而被限制使用等。生物法制备纤维素纳米晶体包括采用酶水解和微生物直接处理木质纤维素两种方式。在2011年，Satyamurthyetal.报道里氏木霉(Trichodermareesei)的菌丝用于发酵5％棉花微晶纤维素经差速离心处理获得纤维素纳米晶体，然而将菌丝与纤维素纳米晶体完全分离存在困难，操作过程复杂，且不易控制产物品质。利用纤维素酶水解木质纤维素原料制备纤维素纳米晶体，具有环境友好、反应条件温和、产物表面有大量活性羟基有利于其改性、所产糖液可被利用实现生物炼制等优点，被认为是一种有发展潜力的制备纤维素纳米晶体的方法。纤维素酶作为预处理手段辅以化学或机械处理制备纳米纤维素，如专利CN201810752004.3用纤维素酶预处理木质纤维素，之后用有机酸处理残渣，经透析，离心后获得纳米纤维素。CN201310716921....

【技术保护点】
1.一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶由如下方法制得：/n(1)基因获得：/n以草酸青霉(Penicillium oxalicum)CGMCC No.5302基因组(GenBank：AGIH00000000.1)为模板用引物cbh1-U-F和cbh1-U-R扩增获得纤维素酶基因(cbh1)(GenBank:GQ844299.1)的启动子序列cbh1(U)，用引物cbh1-D-hphR-F和cbh1-D-R扩增获得纤维素酶基因(cbh1)编码区的下游序列cbh1(D)，用引物Cel7B-cbh1(U)R-F和Cel7B-hphF-R扩增获得基因片段cel7B(GenBank:EU339127.1)，用引物cel5B-F和cel5B-R扩增获得基因片段cel5B(GenBank:KJ 955479)；以里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a ATCC13631的cDNA(GenBank:AAIL00000000.2)为模板用引物swo1-AgpdA(p)R-F和swo1-R扩增得到基因swo1(GenBank:AJ245918.1)；以质粒pA...

【技术特征摘要】
1.一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶由如下方法制得：
(1)基因获得：
以草酸青霉(Penicilliumoxalicum)CGMCCNo.5302基因组(GenBank：AGIH00000000.1)为模板用引物cbh1-U-F和cbh1-U-R扩增获得纤维素酶基因(cbh1)(GenBank:GQ844299.1)的启动子序列cbh1(U)，用引物cbh1-D-hphR-F和cbh1-D-R扩增获得纤维素酶基因(cbh1)编码区的下游序列cbh1(D)，用引物Cel7B-cbh1(U)R-F和Cel7B-hphF-R扩增获得基因片段cel7B(GenBank:EU339127.1)，用引物cel5B-F和cel5B-R扩增获得基因片段cel5B(GenBank:KJ955479)；以里氏木霉(Trichodermareesei)QM6aATCC13631的cDNA(GenBank:AAIL00000000.2)为模板用引物swo1-AgpdA(p)R-F和swo1-R扩增得到基因swo1(GenBank:AJ245918.1)；以质粒pAN7-1(GenBank:Z32698.1)为模板用引物AgpdA(p)-ptrAR-F和AgpdA(p)-R扩增得到构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因编码基因(gpdA)的启动子AgpdA(p)(GenBank:Z32524.1)；以草酸青霉基因组为模板用引物PgpdA(p)-F和PgpdA(p)-Cel5BF-R扩增得到构巢曲霉的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列PgpdA(p)；以质粒pME2892为模板用引物ptrA-Cel5BR-F和ptrA-R扩增得到抗吡啶硫胺素基因ptrA；以质粒pSilent-1(GeneBank：LT827033.1)为模板用引物hph-F和hph-R扩增得到潮霉素抗性基因hph，引物trpC-swo1R-F和trpC-R扩增得到基因trpC终止子将上述基因片段进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化试剂盒纯化目的片段，备用；
其中，上述所用引物的核苷酸序列顺序如下；
cbh1-F：ATGAAGGGTTCCATCTCCTACC
cbh1-R：TTACAGGCACTGGGAGTAGTACTCG
cbh1-U-F：CTCACCACCAGACTGTCGTTTTC
cbh-U-R：TGTGATGGATTGGATCAAAGATC
Cel7B-cbh1(U)R-F：
GATCTTTGATCCAATCCATCACAATGTCTTTCACAAGGAGACAGTTCC
Cel7B-hphF-R：TTCAATATCAGTTAACGTCGCTTCGGATCCATATTCAATTGC
hph-F:CGACGTTAACTGATATTGAA
hph-R:CAACCCAGGGCTGGTGACGG
cbh1-D-hphR-F：CCGTCACCAGCCCTGGGTTGGTCTTGAGTGGTCGTCGAGGTC
cbh1-D-F：GTCTTGAGTGGTCGTCGAGGTC
cbh1-D-R：GTGGTTCGTACTGGGGACCTC
PgpdA(p)-F：ATTATTCATAGTTTCTCCGCCG
PgpdA(p)-Cel5BF-R：
GGCAAGAATCAAATCGTATCTCATTTTTGCGATTGTTTGAAGTGTTC
Cel5B-F：ATGAGATACGATTTGATTCTTGCC
Cel5B-R：TGAGATACGATTTGATTCTTGCC
ptrA-Cel5BR-F：GCATGAACAAGAAAACAAGATCACTGGGCAATTGATTACGGGATC
ptrA-F：GGGCAATTGATTACGGGATC
ptrA-R：ATGGGGTGACGATGAGCCGC
AgpdA(p)-ptrAR-F：GCGGCTCATCGTCACCCCATAGTCAGACGGCGTAACCAAA
AgpdA(p)-F：AGTCAGACGGCGTAACCAAA
AgpdA(p)-R：GGTGATGTCTGCTCAAGCGG
swo1-AgpdA(p)R-F：CCGCTTGAGCAGACATCACCATGGCTGGTAAGCTTATCCTCG
swo1-F：ATGGCTGGTAAGCTTATCCTCG
swo1-R：TCAATTCTGGCTAAACTGCACAC
trpC-swo1R-F：GTGTGCAGTTTAGCCAGAATTGATGATTTAATAGCTCCATGTCAACAA
trpC-R：AACCCAGGGCTGGTGACG；
(2)表达盒构建：
将(1)获得的基因cbh1(U)，cel7B，筛选标记基因hph以及cbh1(D)利用Double-jointPCR方法，先将所述基因片段按照物质的量比为1:2:2:...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵建，杨甜甜，李雪芝，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37

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