新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系技术

本发明专利技术提供了培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触，使得所述胚胎干细胞保持干性。本发明专利技术还提供了培养胚胎干细胞的细胞培养体系(培养基或培养液)，其中含有SF1670，所述细胞培养体系可使得胚胎干细胞保持干性。本发明专利技术提供的胚胎干细胞培养方法和培养体系能够有效地维持干细胞的增殖能力、发育潜能以及干性的稳定性。

New stem factors and their methods or culture systems for culturing embryonic stem cells

【技术实现步骤摘要】
新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系
本专利技术涉及细胞培养方法和细胞培养基领域。具体的，本专利技术提供了一种维持胚胎干细胞的干性的细胞培养方法和细胞培养基。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)起源于早期哺乳动物胚胎的内细胞团[1,2]，其具有自我更新的能力，并且能够分化成为三个胚层的典型细胞类型[3]。哺乳动物的胚胎干细胞具有独特分子和细胞特性的干性，如多能性状态[4]。1981年，英国科学家马丁·埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干细胞领域的研究工作(EvansandKaufman，1981)。随着研究的愈发深入，科学家们对ESCs的多能性调控机制的研究也越来越透彻，推进了ESCs培养体系的跟进和发展：从最初的胎牛血清培养基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到应用最为广泛的“代胎体系”，ESCs培养基的发展实现了从有血清到无血清、从成分不明确到确定化学成分的过程。而且通过培养基的不断更新和发展，在体外成功地得到了各种动物的ESC细胞系。ESC细胞系被广泛用于人类发育生物学、药物发现、药物测试和移植药物。例如，目前对着床后人胚胎的了解主要是基于数量有限的静态组织切片。但是，早期胚胎干细胞干性的根本机制还有待深入研究和充实。小分子抑制剂被广泛用来维持小鼠和灵长类ESCs的干性[5,6]。MAP激酶/ERK激酶(MEK)抑制剂和GSK3抑制剂(2i，PD0325901和CHIR99021)被用来维持小鼠ESCs的原生(naive)干性状态，也能够促进多能性因子的表达，包括Nanog、Oct4和Klf4[7]。白血病抑制因子通过激活转录因子STAT3来驱动小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖[8,9]。小分子化合物CHIR99021抑制GSK3活性，从而调控Wnt/β-catenin信号通路来维持小鼠胚胎干细胞的干性状态[5,7]。BIO(6-bromoindirubin-3’-oxime)也是特异性识别GSK3的小分子抑制剂,参与抑制胚胎干细胞的分化和激活Wnt信号通路，从而维持多能性因子(Rex、Oct4和Nanog)的表达[5]。SF1670是第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白(Phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10，PTEN)的特异性抑制剂。SF1670特应性结合到PTEN的活性位点，从而抑制PTEN活性。PTEN参与抑制PI3K/AKT信号通路，抑制PIP2向PIP3转换，调控多种细胞生物学现象。SF1670可增强fMLP引起的PIP3信号转导，增强AKT磷酸化和活性。已有报道SF1670可以增加中性粒细胞中活性氧的产生，增强PIP3信号，激活中性粒细胞活性，从而增强中性粒细胞减少小鼠的炎症反应和杀菌能力[13]。本领域还需要对胚胎干细胞的干性的机理有更多的了解，以及需要各种能够有效地维持胚胎干细胞的干性的体外培养方法和培养基。
技术实现思路
专利技术人首次和意外发现和证明了SF1670在维持胚胎干细胞的干性包括其多能性中的作用。由此，专利技术人提供了新的和更有效的体外培养胚胎干细胞的方法和培养体系(培养基或培养液)。具体的，在本专利技术的其中一个方面，本专利技术提供了体外培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触。在本专利技术的方法中，SF1670可使得所述胚胎干细胞保持干性。在本专利技术的其中又一个方面，本专利技术的方法使得培养的所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。在本专利技术的其中另一个方面，本专利技术还提供了培养胚胎干细胞的细胞培养体系(培养基或培养液)，其中含有SF1670。所述细胞培养体系可使得胚胎干细胞保持干性。在本专利技术的其中又一个方面，本专利技术的细胞培养体系使得培养的所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。在本专利技术的其中又一个方面，所述胚胎干细胞为来自哺乳动物的胚胎干细胞。在本专利技术中，所述哺乳动物可以为任何哺乳动物，包括和不限于啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊科动物、牛科动物、猪科动物及灵长类动物。所述哺乳动物典型地包括啮齿动物，如小鼠、大鼠，几内亚猪和兔等，以及灵长类动物如人和猴等。在本专利技术中，术语干细胞是指在单细胞水平上具有自我更新和分化产生子代细胞的能力的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于所有或大部分组织形成的能力。在本专利技术中，术语干细胞的干性(stemness)指干细胞的基础活性，包括干细胞的生长、发育和增殖能力，以及分化为一种或者多种细胞的能力。术语干细胞的多能性是指干细胞具备的分化为各种细胞的潜力。干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但所有细胞谱系都只分布于特定组织、器官或生理系统内；(4)寡能，指能够产生比专能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。胚胎干细胞的多能性还可以被分为原始态多能性(nalivepluripotency)和始发态多能性(primedpluripotency)两种状态。这两种状态的细胞在发育上相互联系，具有不同的形态、信号依赖、发育性质、基因表达及表观遗传学性质，并且在特定的条件下可以相互转化。在本专利技术的其中一个方面，本专利技术提供的胚胎干细胞的体外培养方法或培养体系中包括SF1670。在本专利技术的其中又一个方面，本专利技术提供的胚胎干细胞的体外培养方法和培养体系中SF1670的工作浓度为约0.1～约5μM，优选为约0.2～约4μM，最优选为约0.5～约2μM。SF1670的分子结构式如下式所示：SF1670是一种特异性的第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白(Phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10，PTEN)抑制剂。SF1670特应性结合到PTEN的活性位点，从而抑制PTEN活性。PTEN参与抑制PI3K/AKT信号通路，抑制PIP2向PIP3转换，增强AKT磷酸化和活性。在本专利技术的其中又一个方面，胚胎干细胞的体外培养方法和培养体系中包括适合胚胎干细胞的营养物质和细胞因子等。胚胎干细胞的体外培养方法和培养体系(培养基或培养液)的关键作用目的包括维持干细胞的增殖能力、长期培养后的发育潜能以及干性的稳定性。在本专利技术中，所述胚胎干细胞的体外培养方法中的培养液，以及所述胚胎干细胞的培养体系可含有白蛋白或白蛋白替代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种运铁蛋白或运铁蛋白替代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代物、一种或多种胶原前体以及一种或多种痕量元素。所述培养方法中的培养液和所述胚胎干细胞的培养体系还可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.体外培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触，使得所述胚胎干细胞保持干性。/n

【技术特征摘要】
1.体外培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触，使得所述胚胎干细胞保持干性。


2.根据权利要求1所述的方法，其中使得所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞培养液中SF1670的工作浓度为0.1～约5μM，优选为约0.2～约4μM，最优选为约0.5～约2μM。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞培养液含有GSK3抑制剂，例如含有CHIR99021。


5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞培养液不含有GSK3抑制剂，例如不含有CHIR99021。


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【专利技术属性】
技术研发人员：路钢，陈伟仪，王武明，刘强，苏献伟，曾金时，
申请(专利权)人：卓越细胞工程香港有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81