一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，针对现有分离蜜环菌方法存在分离材料受限、易染杂菌、菌株易退化等问题，而创新研究的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括箭麻预处理、组织分离、组织培养、内生真菌分离、纯化与保藏，经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前，需要与天麻进行栽培试验，栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培。本发明专利技术实用性强，操作方便，应用这种方法能达到分离污染率低、分离出的蜜环菌菌株在天麻栽培中侵染性强且不易退化的效果。

A method for isolation of Armillaria from endophytic fungi of Sagittaria

【技术实现步骤摘要】
一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法
本专利技术属于蜜环菌分离
，具体而言，涉及一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法。
技术介绍
蜜环菌属真菌俗名榛蘑、苞谷菌，隶属于真菌界、担子菌亚门、伞菌纲、伞菌目、白蘑科。该属真菌在世界约有40种，在中国分布也较为广泛，华中、西南地区和东北地区均有分布。蜜环菌是名贵中药天麻和猪苓重要的共生菌，天麻95％的生长期间均需要蜜环菌以根状菌索的形式提供营养物质。有研究表明用不同来源的蜜环菌菌株伴栽天麻，天麻的产量和质量不同，同时优质的蜜环菌能够有效的提高天麻素含量。因此，选择与天麻亲和性高的蜜环菌菌种栽培天麻是保障天麻生产的关键因素之一。分离纯化蜜环菌菌种，对获取种质资源以及开展育种工作都具有十分重要的意义，当前常用的分离方法中，子实体分离法由于人工栽培蜜环菌子实体较困难，野生材料难于获得；菌索及菌木分离法技术较为复杂，易染杂菌，操作难度大、成功率低；2006年，肖波等在《微生物学通报》上发表学术论文“蜜环菌菌种分离新法——天麻组织分离法”，利用蜜环菌菌索侵入白麻皮层组织，蜜环菌菌丝体穿插于白麻皮层及细胞间，所以分离材料采用了种麻的表皮组织，但此法存在分离材料受限(仅白麻皮层)、分离培养易染菌的问题，而且菌株性状不稳定高，往往分离当年的菌株活性表现良好，转接到第二、三代后，容易出现菌株退化现象。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，本专利技术通过箭麻预处理、组织分离、组织培养、内生真菌分离、纯化与保藏，以此达到蜜环菌分离、不易染菌、保持种性稳定的目的。为了实现所述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏；所述步骤(1)箭麻预处理：选取当年采集的进入停长期的商品天麻，用自来水冲洗30min，洗净泥沙，避免损伤天麻，再用无菌水将材料冲洗1～2次；所述步骤(2)组织分离：用无菌解剖刀将箭麻切成1cm～2cm长的小段，用刀轻轻刮去表面，用无菌水反复冲洗2～3次，再以75％的酒精冲洗30s，取出后再用无菌水反复冲洗3～4次，在无菌滤纸上吸去表面水分，再置于0.1％升汞溶液浸泡消毒1min，再用无菌水清洗3～4次，用无菌吸水纸吸去表面水分，置于垫有无菌滤纸的表面皿上；所述步骤(3)组织培养：用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm的方形小块，接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上，培养皿用报纸包好，16℃下暗培养3d，能够有效的减少霉菌的污染，再转移至24℃的培养箱中培养15d；所述步骤(4)内生真菌分离：培养期间蒂除有颜色的杂菌，蜜环菌基内菌丝为白色网状分支，观察培养基内部是否有根状菌索伸出，若没有进行二次分离；待透明状或白色菌丝长出，且培养基内部是否有根状菌索伸出后，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d；所述步骤(5)纯化与保藏：所得菌株均采用改良PDA培养基纯化，无菌条件下，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d，直至纯培养，每株菌备份5份，4℃保藏。优选的，所述改良PDA培养基：马铃薯(去皮)200.0g，玉米粉30.0g，葡萄糖20.0g，琼脂12.0g，KH2PO45.0g，MgSO43.0g，蛋白胨5.0g，VB110.0mg，pH自然，加水定容至1000mL；分装至试管中，装液量为试管的2/3，高压灭菌后直立放置，待用。优选的，所述含有抗生素的改良PDA培养基：在所述改良PDA培养基中添加氯霉素25μg/mL和链霉素10μg/mL，培养基经高温高压灭菌后，冷却至40℃～50℃左右添加氯霉素和链霉素，其中氯霉素的贮存液浓度为34mg/mL，链霉素的贮存液浓度为10mg/mL。优选的，经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前，需要与天麻进行栽培试验，所述栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培。优选的，所述白麻+蜜环菌的无性栽培选择室内栽培，栽培用培养箱采用长×宽×高＝65cm×40cm×45cm的PP塑料培养箱，培养箱底部先铺层河沙，厚度5cm，放上栽培菌材，菌材之间间隔为6cm～8cm，放入培养好的蜜环菌三级种，保证菌材的截面与鳞口必须摆放蜜环菌，紧贴蜜环菌摆放白麻，盖上湿度为60％的河沙与木屑的混合物，厚度以完全覆盖菌材10cm为宜。优选的，所述天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培是在培养箱中铺5cm厚潮湿的河沙，将培养好的萌发菌栽培种撕开，均匀平铺于培养箱中，将天麻蒴果种子均匀的洒上后，拌匀，附上保鲜膜，保鲜膜用牙签均匀扎眼，便于透气，于24℃下培养3d～5d，待树叶表面变白，即可用于栽培种子。优选的，温度控制在25℃以下，夏季最高不超过30℃，湿度控制在60％，管理期间不需要施肥和松土，秋季湿度控制在50％左右，冬季湿度在30％即可，生长期为8个月，产量统计以白麻重量表示。优选的，所述蜜环菌三级种的制备为选择预先分离筛选的蜜环菌菌种，制备蜜环菌栽培种，栽培种选用550mL的塑料栽培瓶，栽培配方为枝条80％，豆粉9％，玉米粉10％，蔗糖1％，混匀，加水至瓶口2cm处，采用高压蒸汽灭菌锅，121℃，1.1KPa灭菌2h，冷却至常温后接种，24℃培养50d。优选的，所述萌发菌栽培种的制备为青冈木树叶80％，木屑10％，麸皮10％，加水拌匀，湿度在60％左右，装袋，选用17cm×33cm的聚丙烯菌袋，采用高压蒸汽灭菌锅，121℃，1.1KPa灭菌2h，冷却至常温后接种，24℃培养50d。优选的，所述菌材为长度30cm、直径6cm～8cm，所述菌材使用前砍深度约2cm的鱼鳞口，所述菌材选择青冈木材料。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术从箭麻组织中分离的内生真菌，进而选育的蜜环菌菌株，与天麻的亲和性高，选择与天麻亲和性高的蜜环菌菌种栽培天麻是保障天麻生产的关键因素之一。相对于传统子实体或孢子分离方法，具有生长速度快，污染率低等优势，分离出的菌株受药物刺激少，与天麻的亲和性好，在天麻栽培中侵染性较强，克服了传统复壮方法难以解决的蜜环菌退化问题。2、本专利技术采用了一套避免杂菌污染措施。在组织分离时需要精确掌握75％酒精和0.1％升汞的浸泡时间，时间过短，杀菌不彻底，时间过长，菌索失去活力。在分离过程中，先在16℃下暗培养3d，能够有效的减少霉菌的污染，在分离培养基中添加2种或两种以上抗生素能够有效避免细菌的污染。菌株形态特征观察中，要经常进行观察记录，若出现菌株污染现象，应及时转接或补充。3、本专利技术创新了改良PDA培养基，菌丝的浓密度与培养基的营养成分有很大关系，选择合适的培养基，调整好碳氮比，能够有效的提高菌种的性状。4、本专利技术提出经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前，需要与天麻进行白麻+蜜环菌的无性栽培试验、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏；/n所述步骤(1)箭麻预处理：选取当年采集的进入停长期的商品天麻，用自来水冲洗30min，洗净泥沙，避免损伤天麻，再用无菌水将材料冲洗1～2次；/n所述步骤(2)组织分离：用无菌解剖刀将箭麻切成1cm～2cm长的小段，用刀轻轻刮去表面，用无菌水反复冲洗2～3次，再以75％的酒精冲洗30s，取出后再用无菌水反复冲洗3～4次，在无菌滤纸上吸去表面水分，再置于0.1％升汞溶液浸泡消毒1min，再用无菌水清洗3～4次，用无菌吸水纸吸去表面水分，置于垫有无菌滤纸的表面皿上；/n所述步骤(3)组织培养：用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm的方形小块，接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上，培养皿用报纸包好，16℃下暗培养3d，能够有效的减少霉菌的污染，再转移至24℃的培养箱中培养15d；/n所述步骤(4)内生真菌分离：培养期间蒂除有颜色的杂菌，蜜环菌基内菌丝为白色网状分支，观察培养基内部是否有根状菌索伸出，若没有进行二次分离；待透明状或白色菌丝长出，且培养基内部是否有根状菌索伸出后，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d；/n所述步骤(5)纯化与保藏：所得菌株均采用改良PDA培养基纯化，无菌条件下，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d，直至纯培养，每株菌备份5份，4℃保藏。/n...

【技术特征摘要】
1.一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏；
所述步骤(1)箭麻预处理：选取当年采集的进入停长期的商品天麻，用自来水冲洗30min，洗净泥沙，避免损伤天麻，再用无菌水将材料冲洗1～2次；
所述步骤(2)组织分离：用无菌解剖刀将箭麻切成1cm～2cm长的小段，用刀轻轻刮去表面，用无菌水反复冲洗2～3次，再以75％的酒精冲洗30s，取出后再用无菌水反复冲洗3～4次，在无菌滤纸上吸去表面水分，再置于0.1％升汞溶液浸泡消毒1min，再用无菌水清洗3～4次，用无菌吸水纸吸去表面水分，置于垫有无菌滤纸的表面皿上；
所述步骤(3)组织培养：用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm的方形小块，接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上，培养皿用报纸包好，16℃下暗培养3d，能够有效的减少霉菌的污染，再转移至24℃的培养箱中培养15d；
所述步骤(4)内生真菌分离：培养期间蒂除有颜色的杂菌，蜜环菌基内菌丝为白色网状分支，观察培养基内部是否有根状菌索伸出，若没有进行二次分离；待透明状或白色菌丝长出，且培养基内部是否有根状菌索伸出后，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d；
所述步骤(5)纯化与保藏：所得菌株均采用改良PDA培养基纯化，无菌条件下，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d，直至纯培养，每株菌备份5份，4℃保藏。


2.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：所述改良PDA培养基：马铃薯(去皮)200.0g，玉米粉30.0g，葡萄糖20.0g，琼脂12.0g，KH2PO45.0g，MgSO43.0g，蛋白胨5.0g，VB110.0mg，pH自然，加水定容至1000mL；分装至试管中，装液量为试管的2/3，高压灭菌后直立放置，待用。


3.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：所述含有抗生素的改良PDA培养基：在所述改良PDA培养基中添加氯霉素25μg/mL和链霉素10μg/mL，培养基经高温高压灭菌后，冷却至40℃～50℃左右添加氯霉素和链霉素，其中氯霉素的贮存液浓度为34mg/mL，链霉素的贮存液浓度为10mg/mL。


4.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：经过分离纯化、...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海彬，赵赟鑫，叶彦慧，解修超，彭浩，张晓程，李庆勇，
申请(专利权)人：汉中市汉台区汉麓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61