一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种粗多糖的提取纯化技术，特别涉及一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法。本发明专利技术利用蛋白酶K的特异性酶解活性去除杂质蛋白，具体方法为：将海藻粗多糖溶解于Tris‑HCl‑CaCl

A method to remove the impurity protein from the polysaccharide of seaweed

【技术实现步骤摘要】
一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法
本专利技术属于海洋生物综合利用领域，涉及一种粗多糖的提取纯化方法，特别涉及一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法。
技术介绍
海藻作为重要的经济型海洋资源，已成为当代开发研究的热点。海藻具有纯绿色，纯天然，且资源丰富等诸多优势。国内外学者对海藻的研究均表明海藻中富含大量的钙、矿物质、膳食纤维、多肽、黄酮等成分，同时多糖和维生素的含量也很丰富具有诸多保健功能。目前以海藻为原料开发上市的食品和保健品已在市场中备受广大消费者的青睐。随着近年来海藻研究的进一步发展，发现多糖也是藻类的重要活性物质之一，具有抗菌功效，可以调节免疫系统，同时具有一定的降脂减肥功效。石珊瑚叠层藻(Lithothamnionsuperpositum，石层藻)是南美洲海岸发现的一种红色珊瑚藻，归属于轮藻门珊瑚目石藻属。石层藻广泛分布于热带和亚热带的海岸附近，含有丰富的钙和多种元素，也被称为藻类钙质。它是一种重要的进口型经济海藻，并在化妆品、纺织，特别是食品行业有广泛的应用，已经被制成多种类型的食品和保健品，具有较好的市场开发前景。现有的结果表明，石层藻多糖能减轻血管紧张素Ⅱ诱导的冠状动脉内皮细胞炎症，石层藻中的多糖硫酸酯对α-淀粉酶和α-半乳糖苷酶具有一定的抑制作用，通过对硫酸化半乳聚糖进行化学修饰得到的多糖偶联物能增强5-F基团的抗肿瘤活性。总体而言，多糖已经成为海藻类活性物质先导化合物及开发新食品药品添加剂的重要源泉。与此同时，海藻多糖的提取、分离纯化等制备工艺也成为了研究热点。目前海藻多糖的提取方法主要有水提法、超声提取法、微波提取法以及酶法等，但这些方法均为非特异性的提取方法。并且提取所得到的通常为海藻粗多糖，其中含有大量的杂质蛋白质。这些蛋白在海藻多糖中含量较高，甚至可高达30％左右，严重影响海藻多糖的纯度，给后续研究增加难度。除去海藻多糖中的杂质，进一步纯化提高多糖纯度，是海藻多糖开发利用急需解决的技术难点。目前去除海藻粗多糖中杂质蛋白的常用方法主要有三氯乙酸法(TCA法)、酸碱法、Sevage法等。其中TCA法是根据蛋白在有机酸的作用下失活，形成不可逆的沉淀，从而去除粗多糖中的蛋白杂质，但该方法需要重复操作，且使多糖降解，活性减弱，损失较大。酸碱法则是利用粗多糖中酸性蛋白在酸的作用下沉淀、碱性蛋白在碱的作用下沉淀的性质以除去样品中的蛋白，但对于多糖结构有一定的破坏作用。Sevage法是目前较常用的脱蛋白法，其原理是根据蛋白质在氯仿等有机溶液中易变性的性质，操作相对简便，但加入的大量有机溶剂会影响海藻多糖的品质，需要进一步去除残留溶剂，效率较低。近些年也出现一些去除海藻中杂质的新方法，如吸附法采用的是大孔树脂、活性炭及合成的具有吸附能力的多孔材料，依赖范德华力或氢键等作用力，通过非特异性吸附去除粗多糖中的杂质。但是吸附法存在操作时间长、多糖损失严重等问题。而酶法的特点在于专一性强、可特异性去除杂质蛋白。目前也有报道采用酶法去除多糖中的蛋白杂质，但所用酶的成本相对较高，且存在灭活温度高、易破坏多糖结构和活性等问题，使其应用范围受到限制。综上所述，虽然近年来在海藻多糖的提取、纯化技术研究方面取得了一定进展，但现有的纯化除杂方法仍以非特异性方法为主，且各有利弊，普遍存在操作繁琐、试剂浪费、除杂效率低等诸多问题。
技术实现思路
针对现有技术所存在的缺陷，本专利技术旨在提供一种高效的特异性去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，提高了海藻多糖的纯度。本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，包括如下步骤：将海藻粗多糖溶解于缓冲体系，震荡溶解，得粗多糖溶液；在粗多糖溶液中加入蛋白酶K溶液，得到酶解液；在酶解液中加入无水乙醇，在0-5℃下沉淀，分离得到海藻多糖。蛋白酶K(ProteinaseK)归属于枯草杆菌蛋白酶类，是一种来源于酵母菌的高活性丝氨酸蛋白酶，切割活性广泛，可通过切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，达到特异性降解蛋白的目的。海藻粗多糖中的杂质蛋白酶解为小分子肽段后，在后期加入有机溶剂时就不会被沉淀。蛋白酶K可最大程度的去除海藻粗多糖中的杂质蛋白，同时保证海藻多糖的结构不被破坏，实现高效的分离纯化。优选地，本专利技术所用缓冲体系为50mM的Tris-HCl缓冲液和10mM的CaCl2溶液混合得到的Tris-HCl-CaCl2溶液。蛋白酶K的pH适用范围广，反应条件温和，活性高，价格低廉，安全性较高。蛋白酶K有两个Ca2+结合位点，且该位点离酶的活性中心有一定距离，而在Ca2+存在的条件下可以有效的保护proteinaseK不自溶，同时增加其热稳定性，因此本专利技术溶解粗多糖的缓冲液中加入了适量CaCl2，CaCl2溶液中的Ca2+还有助于提高酶的活力。优选地，上述Tris-HCl-CaCl2溶液中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。进一步优选，上述Tris-HCl-CaCl2溶液中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8。优选地，本专利技术所用蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。优选地，本专利技术所用蛋白酶K溶液为将蛋白酶K溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液制得，Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。进一步优选，本专利技术中溶解蛋白酶K的Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8。蛋白酶K在4-12.5的pH范围内均有活性，常规的Tris-HCl缓冲液为中性至碱性，而本专利技术在试验中发现缓冲液的pH值对粗多糖中杂质蛋白的去除率有一定影响，当Tris-HCl缓冲液为中性偏微酸性时，蛋白酶K的酶解和乙醇沉淀除杂的效果最好。优选地，本专利技术在酶解液中加入无水乙醇之前，先将酶解液在55-65℃下孵育1-3小时，再冷却至0-5℃。蛋白酶K的理想孵育温度为55-60℃，理想孵育时间为2-2.5小时，而当温度超过65℃时就会迅速变性。在上述孵育温度和孵育时间内，蛋白酶K可使海藻粗多糖中的蛋白充分酶解，再利用乙醇在低温下对多糖的沉淀能力，进一步分离得到纯化的海藻多糖。优选地，本专利技术用于酶解液沉淀的无水乙醇为预先冷却的食用级乙醇，所述酶解液与加入的无水乙醇的体积比为1:6-8。优选地，本专利技术在酶解液中加入无水乙醇后，静置沉淀4-10小时。进一步优选，本专利技术中加入乙醇后的沉淀温度为4℃，沉淀时间为5小时。优选地，本专利技术所述的海藻粗多糖通过水提醇沉法制得，具体包括如下步骤：将海藻粉碎，烘干，得到海藻粉末；称取海藻粉末置于圆底烧瓶中，加入15-30倍质量的蒸馏水，水浴提取得到提取液；提取液浓缩后得到浓缩液，加入6-8倍体积的无水乙醇，静置沉淀，离心；将离心后的沉淀用无水乙醇洗涤2-5次，干燥，得到海藻粗多糖。优选地，本专利技术采用水浴法提取海藻中的粗多糖类物质，具体为在80-85℃的恒温条件下水浴90-120min。优选地，本专利技术制备粗多糖的醇沉条件为在0-5℃下静置沉淀4-8h。优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n将海藻粗多糖溶解于缓冲体系，震荡溶解，得粗多糖溶液；/n在粗多糖溶液中加入蛋白酶K溶液，得到酶解液；/n在酶解液中加入无水乙醇，在0-5℃下沉淀，分离得到海藻多糖。/n

【技术特征摘要】
1.一种去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将海藻粗多糖溶解于缓冲体系，震荡溶解，得粗多糖溶液；
在粗多糖溶液中加入蛋白酶K溶液，得到酶解液；
在酶解液中加入无水乙醇，在0-5℃下沉淀，分离得到海藻多糖。


2.根据权利要求1所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲体系为50mM的Tris-HCl缓冲液和10mM的CaCl2溶液混合得到的Tris-HCl-CaCl2溶液。


3.根据权利要求2所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述Tris-HCl-CaCl2溶液中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7.2。


4.根据权利要求1所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。


5.根据权利要求4所述的去除海藻粗多糖中杂质蛋白的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液为将蛋白酶K溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液制得，Tris-HCl缓冲液的pH值为6.5-7....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙妍，周海滨，潘道东，俞伟，洪舟，陈力，
申请(专利权)人：宁波立华制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33