一种雄黄微生物浸出作为PML-RARα蛋白抑制剂的应用制造技术

一种雄黄微生物浸出液在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。本发明专利技术所提供的雄黄微生物浸出液可以显著降低急性早幼粒细胞白血病细胞中癌蛋白PML‑RARα蛋白的含量，从而在制备抑制急性早幼粒细胞白血病细胞的增殖，并促使癌细胞向正常早幼粒细胞分化药物中应用。

Application of realgar bioleaching as a protein inhibitor of PML-RAR \u03b1

【技术实现步骤摘要】
一种雄黄微生物浸出作为PML-RARα蛋白抑制剂的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种雄黄微生物浸出液(RTS)的新用途，具体涉及一种雄黄微生物浸出液的在制备降解癌蛋白PML-RARα药物中的应用。
技术介绍
90％以上的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者存在一种特异的t(15；17)染色体易位，该易位是由于位于17号染色体上的维甲酸受体α(RARα)基因与15号染色体上的早幼粒细胞(PML)基因发生交互易位，从而形成PML-RARα癌蛋白引起的[1]，PML-RARα癌蛋白不但能够促进APL的发展，还能阻滞分化基因的转录，从而导致APL停留在早幼粒阶段[2,3]。因此，癌蛋白PML-RARα已成为治疗急性早幼粒细胞白血病的靶标。雄黄经过微生物浸出后，活性成分较雄黄原药相比发生了很大变化，雄黄微生物浸出液中不仅存在三价砷和五价砷，还存在有机砷。本专利技术中发现了作为PML-RARα蛋白抑制剂的应用，雄黄微生物浸出液不仅在对PML-RARα蛋白的抑制活性方面优于三氧化二砷制剂和雄黄，且毒性更低。本专利技术实验结果显示雄黄微生物浸出液能够显著抑制急性早幼粒细胞白血病细胞的增殖，并诱导急性早幼粒细胞白血病细胞的分化，达到减缓急性早幼粒细胞白血病进程的目的，可作为PML-RARα蛋白抑制剂，也可用于制备抑制急性早幼粒细胞白血病细胞的增殖的药物，促使癌细胞向正常早幼粒细胞分化。参考文献1.董硕,陈竺,and王振义,急性早幼粒细胞白血病的分子生物学研究进展.国际输血及血液学杂志,1992(3):p.147-149.2.Chen,S.-J.,etal.,Fromanoldremedytoamagicbullet:molecularmechanismsunderlyingthetherapeuticeffectsofarsenicinfightingleukemia.Blood,2011.117(24):p.6425-6437.3.Vitaliano-Prunier,A.,etal.,ClearanceofPML/RARA-boundpromoterssufficetoinitiateAPLdifferentiation.Blood,2014.124(25):p.3772-80.
技术实现思路
：本专利技术公开了一种雄黄微生物浸出液作为PML-RARα蛋白抑制剂的应用。本专利技术还公开了一种雄黄微生物浸出液在制备抑制急性早幼粒细胞增殖的药物中的应用。本专利技术还公开了一种雄黄微生物浸出液在制备促使癌细胞向正常早幼粒细胞分化的药物中的应用。本专利技术还公开了一种雄黄微生物浸出液在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。本专利技术所述雄黄微生物浸出液的制备方法，具体方法如下：称取雄黄，过筛，灭菌，加入锥形瓶中，加入灭菌后的9K无铁液体培养基，用硫酸调pH至1.75，待pH稳定后，接种体积分数为20％氧化亚铁硫杆菌，添加FeSO4使培养基的Fe2+的终浓度达到1.0g/L，称取质量后，在30℃、振荡速度为135rpm时摇瓶浸出30天，实验过程中采用体积比为1：1的硫酸水溶液调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分，摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液pH至7左右，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄微生物浸出液。本专利技术技术方案的有益效果是：相对于ATO、雄黄等其它砷制剂，雄黄微生物浸出液可以更明显降低急性粒细胞白血病细胞中癌蛋白PML-RARα的含量，并抑制急性粒细胞白血病细胞的增殖和诱导癌细胞向正常粒细胞分化。具体实施方式：下面结合具体实施例进一步详细描述本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不局限于以下实施例。实施例一雄黄微生物浸出液的制备采用细菌处理方法处理雄黄，实施方案如下：称取雄黄，过筛，灭菌，加入锥形瓶中，加入灭菌后的9K无铁液体培养基，用硫酸调pH至1.75，待pH稳定后，接种体积分数为20％氧化亚铁硫杆菌，添加FeSO4使培养基的Fe2+的终浓度达到1.0g/L，称取质量后，在30℃、振荡速度为135rpm时摇瓶浸出30天，实验过程中采用体积比为1：1的硫酸水溶液调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分，摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液pH至7左右，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄微生物浸出液。实施例二雄黄微生物浸出液对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞的生长抑制作用1.实验分组：RTS组：雄黄微生物浸出液ATO组：三氧化二砷Realgar组：雄黄2.细胞培养：用RPMI1640培养基，加10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37℃、5％CO2条件下培养。每1天换一次培养液。3.MTT试验：将急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞以约105个/mL的密度接种于96孔板上，每孔100微升。分别按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液RTS、ATO、Realgar，每一梯度至少6个重复，继续培养24小时后，每孔加入5μg/mL的MTT15μL，继续置于37℃温育4小时，加入三联液100μL，37℃孵育过夜，用酶标仪检测，根据测得OD值绘制抑制曲线，计算半数抑制浓度IC50。4.实验结果表1显示RTS、ATO、Realgar都能抑制急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4的生长，且RTS抑制急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞生长的能力明显强于ATO和Realgar。该结果表明APL细胞对RTS更为敏感。表1：RTS、ATO、Realgar对白血病细胞株NB4的半数抑制率IC50实施例三雄黄微生物浸出液对白血病细胞株NB4细胞PML-RARα蛋白含量的影响。1.实验分组：同实施例二。2.细胞培养：用RPMI1640培养基，加10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37℃、5％CO2条件下培养。每1天换一次培养液。3.免疫印迹实验：(1)蛋白样品的制备。急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞培养在10％胎牛血清、青霉素链霉素各含100U/mL的RPMI1640培养液中，培养至对数生长期后将细胞铺于六孔板，同步化过夜，加入不同砷浓度(0.125μg/mL,0.25μg/mL,0.5μg/mL)RTS，等砷浓度(0.25μg/mL)的RTS、ATO、Realgar以及联合0.25μM蛋白酶体抑制剂MG132给药干预24h之后收取细胞，各组细胞加PMSF与RIPA混合裂解液，于冰上裂解30rnin，12000×g，4℃离心后弃沉淀，收集上清用蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，其余样品分装-20℃冻存。(2)SDS-PAGE分离蛋白。蛋白上样量设为每孔30μg。上样前将每组样品与Loadingbuffer混匀，100℃热变性10min。SDS-PAGE采用5％浓缩胶，12％分离胶，以浓缩胶80V，分离胶120V进行蛋白电泳实验。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雄黄微生物浸出液作为PML-RARα蛋白抑制剂的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种雄黄微生物浸出液作为PML-RARα蛋白抑制剂的应用。


2.一种雄黄微生物浸出液在制备抑制急性早幼粒细胞增殖的药物中的应用。


3.一种雄黄微生物浸出液在制备促使癌细胞向正常早幼粒细胞分化的药物中的应用。


4.一种雄黄微生物浸出液在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。


5.如权利要求1所述的雄黄微生物浸出液的应用，其特征在于，所述的雄黄微生物浸出液的制备方法如下：称取雄黄，过筛，灭菌，加入无菌9K无铁液体培养基；用硫酸调pH至1.75，接种体积分数为20％氧化亚铁硫杆菌，加入FeSO4使培养基的Fe2+终浓度为1.0g/L，在30℃、振荡速度为135rpm时摇瓶浸出30天，浸出过程中采用体积比为1:1的硫酸水溶液调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分，摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液pH至7左右，除菌后即得雄黄微生物浸出液。


6.如权利要求2所述的雄黄微生物浸出液的应用，其特征在于，所述的雄黄微生物浸出液的制备方法如下：称取雄黄，过筛，灭菌，加入无菌9K无铁液体培养基；用硫酸调pH至1.75，接种体积分数为20％氧化亚铁硫杆菌，加入FeSO4使培养基的Fe2+终浓度为1.0g/L，在30℃、振荡速度为135rpm时摇瓶浸出30天...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红玉，海洋，李洋，戴治娟，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62