检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法制造技术

本发明专利技术涉及一种从血液中检测新型血栓标志物TAT（凝血酶‑抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法。制备的试剂盒包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，TAT的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现凝血酶‑抗凝血酶复合物的准确定量。

Electrochemiluminescence kit and method for the detection of Tat (thrombin antithrombin complex)

【技术实现步骤摘要】
检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法
本专利技术涉及一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析

技术介绍
凝血酶(thrombin)是一种多功能丝氨酸蛋白水解酶，具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列与结构。它含A、B两条多肽链，由一个链间二硫键相连。β链为功能链，具有典型的丝氨酸蛋白水解酶折叠结构，含有1个位于两个β折叠桶之间的活性中心，2个外结合位点，1个Na离子结合位点，一个自我催化水解环以及一个W60d环。凝血酶具有Na离子诱导的变构酶特性，在血液中有Na离子结合型和Na离子解离型两种构象。这两种构象是可以相互转化的，其相互转化的部分机理是由于效应因子或底物结合到凝血酶的特定位点而引起构象发生变化和能量转移，从而改变了Na离子结合与解离的平衡状态1。凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。而且还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。还具有激活受体，产生细胞生物学效应，如诱发炎症、诱导细胞释放细胞因子、引起细胞增殖、组织器官再生等。中枢神经系统的凝血酶还具有神经毒性，会引起脑细胞损伤。凝血酶半衰期较短，很难检测到，因此我们可以检测凝血酶与抗凝血酶所形成的复合物。升高说明与DIC，DVT，PE以及心房颤动等其他凝血系统激活状态有关2。目前已有的检测凝血酶-抗凝血酶复合物的方法很少，主要是Elisa方法和极少的管式化学发光方法。Elisa方法有显著的缺陷，灵敏度低，重现性差，操作不便等。而管式化学发光方法也存在酶标抗体稳定性较差，结果重现性低等多个问题。作为免疫分析技术中优势明显的电化学发光免疫分析技术，在测定结果的准确性和操作便利性等方面都具有显著优势。目前尚未有电化学发光技术用于TAT检测的成熟方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为提升现有技术中对TAT检测的效果和水平，提供一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒及制法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。优选地，所述凝血酶抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。优选地，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(TritonX-100)和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween20)和/或月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。优选地，所述生物素标记的凝血酶抗体以及三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1mg/L～100mg/L的鼠IgG、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的Brij35和/或TritonX-100和/或Tween20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。优选地，所述检测TAT的电化学发光试剂盒还包括TAT校准品工作液和/或质控品工作液，所述TAT校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij35和/或TritonX-100和/或Tween20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。优选地，所述清洗液为pH为13以上，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的KOH液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L的三丙胺、0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。本专利技术还提供一种上述检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒的制法，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的凝血酶抗体工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液的制备，清洗液的配制，电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。优选地，所述生物素标记的凝血酶抗体的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与凝血酶抗体按照1-20:1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析除去多余的生物素，得生物素标记的凝血酶抗体。优选地，所述三联吡啶钌标记抗抗凝血酶抗体的制备方法为：将pH为6.5-8.0的抗抗凝血酶抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗抗凝血酶抗体与Ru-NHS酯的质量比为5-20:1，37℃避光反应1-3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记抗抗凝血酶抗体。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法，制备的试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现TAT的准确定量；尤其是将该试剂盒用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的TAT，使检测更快速、更可靠、更稳定。具体实施方式现在对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1检测TAT的电化学发光试剂盒的制备方法1)链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备将链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液，磁分离去除上清，用pH为6.8，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液重悬至浓度为0.5mg/mL，所述缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。


2.根据权利要求1所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述凝血酶抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段。


3.根据权利要求1或2所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。


4.根据权利要求1-3任一项所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的凝血酶抗体以及三联吡啶钌标记的凝血酶抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、1mg/L～100mg/L的鼠IgG、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。


5.根据权利要求1-4任一项所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒还包括TAT校准品工作液和/或质控品工作液，所述TAT校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、...

【专利技术属性】
技术研发人员：泮锋纲，丁俊杰，施启尧，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32