用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于真菌病原学检测的领域，公开了用于检测隐球菌的引物和探针，所述引物是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物；所述探针包括检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针。本发明专利技术将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵时间。

Primers and probes for rapid detection and identification of Cryptococcus and their application

【技术实现步骤摘要】
用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用
本专利技术属于真菌病原学检测的领域，具体涉及用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用。
技术介绍
隐球菌属在真菌分类学上属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科，隐球菌属内种类较多，在自然界分布很广，其中引起人类感染的主要是新生隐球菌和格特隐球菌。近年来，国内外隐球菌感染呈上升趋势。由于隐球菌感染后仅根据临床表现容易误诊，病原学检测是诊断和治疗的主要依据。现阶段主要的隐球菌检测方法都存在局限性，其中，脑脊液墨汁染色可以初步观察隐球菌的形态，但敏感性低；隐球菌抗原试剂可以快速检测隐球菌抗原，但不能区分新生隐球菌和格特隐球菌；隐球菌培养鉴定也难以鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。文献“新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定，冯晓博《中华皮肤科杂志》2012年”建立了一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR），用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌，该方法需要针对每一种菌设计引物，方法比较繁琐，反应不够快捷；专利“CN2017101725670”公开了一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒，属于医学真菌学的领域。根据隐球菌的靶基因，设计该检测隐球菌基因的引物序列如SEQIDNo.3与SEQIDNo.4和/或SEQIDNo.6与SEQIDNo.7所示，其中SEQIDNo.3与SEQIDNo.4对应于新生隐球菌，SEQIDNo.6与SEQIDNo.7对应于格特隐球菌，可以在同一体系中用于特异性检测新生隐球菌与格特隐球菌两种隐球菌”，该方法只是将特异性扩增新生隐球菌和格特隐球菌引物和检测探针进行组合，需要使用两套扩增引物，成本更高，扩增反应相对繁琐。因此，需要新的技术和方法来正确检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，并针对不同隐球菌对症下药，以减少诊断误差，避免药物滥用。
技术实现思路
本专利技术为了克服传统检测新生隐球菌和格特隐球菌方法的操作繁琐、灵敏度低、错误率高等缺陷，提供一种用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。用于检测隐球菌的引物和探针，所述引物是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物；所述探针包括检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针。具体地，用于检测隐球菌的引物和探针，所述引物由SEQIDNO：1所示的上游引物和SEQIDNO：2所示的下游引物组成；所述探针包括检测新生隐球菌的探针1和检测格特隐球菌探针2。进一步地，所述探针1如SEQIDNO：3所示，用于检测新生隐球菌；所述探针2如SEQIDNO：4所示，用于检测格特隐球菌。作为本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及用于检测隐球菌的检测工具，其包括上述的引物和探针。优选地，所述检测工具为检测试剂盒。更优选地，所述检测试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、MgCl2以及TaqDNA聚合酶。更优选地，所述隐球菌为新生隐球菌和格特隐球菌。作为本专利技术的另一方面，本专利技术还要求保护上述的引物和探针在制备用于检测隐球菌的试剂盒中的应用。优选地，所述隐球菌为新生隐球菌和格特隐球菌。与现有技术相比较，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几点：本专利技术通过基因组学方法比对数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列差异，选择保守序列和差异序列，设计出引物和探针，在进行检测和鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的过程中，具备敏感性高、特异性强的特点，灵敏度可达到0.05ng/ul，较现有技术提高两个数量级。另外，利用本专利技术试剂盒检测新生隐球菌和格特隐球菌时操作简单、检测时间短、适用性强的特点，本专利技术将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行更早期快速准确的临床诊断，减少药物滥用，为疾病治疗赢得宝贵时间。附图说明图1：新生隐球菌在不同浓度DNA(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；图2：格特隐球菌在不同浓度DNA(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；图3：新生隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；图4：格特隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；图5：新生隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌；图6：格特隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1新生隐球菌与格特隐球菌检测与鉴定的靶基因、引物、探针及其试剂盒通过高通量测序技术获得了数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列，通过基因组学方法比对数十个隐球菌基因组序列差异，并通过初步的引物和探针设计，最终选择CAP59序列作为靶基因，该基因片段在两种隐球菌种内比较保守，并在新生隐球菌和格特隐球菌间存在一定的差异。检测新生隐球菌和格特隐球菌靶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。针对选择的靶基因序列信息进行引物设计。通过反复对比分析，最终设计出能够用于新生隐球菌和格特隐球菌检测与鉴定的实时荧光PCR检测引物和探针；所述特异性检测与鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的特异性寡核苷酸引物序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，该引物对是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物。所述检测新生隐球菌的探针序列如SEQIDNO：3所示，检测格特隐球菌的探针序列如SEQIDNO：4所示，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团，5’端连接有一个荧光报告基团。所述引物序列如SEQIDNO：1所示：5’-GTATTCGATACGGTGGTTGAACAGA-3’（Tm=62.4℃）和SEQIDNO：2所示：5’-GGTTCCAACGACCAGACAAAGG-3’（Tm=63.2℃）；所述探针序列分别为SEQIDNO：3所示：FAM5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1用于检测新生隐球菌（Tm=70.2℃），和SEQIDNO：4所示：HEX5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1用于检测格特隐球菌（Tm=71.1℃）。所述引物特异性识别新生隐球菌中SEQIDNO：5所示的序列和格特隐球菌中SEQIDNO：6所示的序列。用于检测隐球菌的试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测隐球菌的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；所述探针包括检测新生隐球菌的探针1和检测格特隐球菌探针2；所述探针1为：FAM 5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1；所述探针2为：HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测隐球菌的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对由SEQIDNO：1所示的上游引物和SEQIDNO：2所示的下游引物组成；所述探针包括检测新生隐球菌的探针1和检测格特隐球菌探针2；所述探针1为：FAM5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1；所述探针2为：HEX5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。


2.用于检测隐球菌的检测工具，其特征在于，所述检测工具包括权利要求1所述的引物对和探针组合。


3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京世纪坛医院，
类型：发明
国别省市：北京;11