利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法技术

本发明专利技术公开了利用BmIML‑2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，所述方法在上蔟前最后一次给桑时添食核型多角体病毒，并以BmIML‑2基因的转录水平为检测指标，判断家蚕对病毒的抗性强弱。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述方法选择5龄期上蔟前添毒，能够缩短试验周期，工作量小，且减少家蚕之间相互交叉感染的几率；(2)本发明专利技术所述方法筛选后的家蚕品种对核型多角体病毒的抗性提高10‑100倍；(3)本发明专利技术所述方法筛选后的家蚕品种经多代饲养抗性稳定，体质强健。

Screening the resistance of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus with bmiml-2 gene

【技术实现步骤摘要】
利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法
本专利技术属于家蚕良种选育
，涉及一种采用基因工程方法选育家蚕抗病毒品种的技术，具体为利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法。
技术介绍
家蚕作为重要的经济昆虫和模式昆虫，在科学研究、丝绸生产以及促进农民增收等方面意义重大。由家蚕核型多角体病毒引发的家蚕血液型脓病是蚕业生产上危害最为严重的蚕病，该病传染性极强且难于防控，所造成的经济损失占蚕病总损失的70％～80％。关于家蚕核型多角体病毒抗性品种的培育一直是业界重要的研究方向，家蚕核型多角体病毒抗性关键基因的筛选也是科研工作者培育家蚕抗性新品种的重要工作之一。传统的筛选方法在家蚕2龄或3龄等幼虫期进行病毒添食，该方法在蚕期容易污染家蚕饲养环境，造成家蚕之间的相互感染。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本专利技术通过在上蔟前最后一次给桑时添食家蚕核型多角体病毒，并以免疫相关基因的转录水平为检测指标来筛选对核型多角体病毒高抗性的品种；鉴于此，本专利技术提供了利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法。技术方案：利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)选取至少一个家蚕品种为试验材料并饲养至5龄期；采用核型多角体病毒溶液浸泡新鲜桑叶；(2)待上蔟前最后一次给桑时，向每个品种的家蚕幼虫添食步骤(1)的桑叶，然后继续饲养直至上蔟结茧，期间淘汰病死蛹，发蛾后制种；(3)取步骤(2)制种的蚕蛾，提取组织中的RNA并反转录为cDNA，根据BmIML-2基因全长序列设计引物，以cDNA为模板，通过RT-PCR检测家蚕BmIML-2基因在每个家蚕品种中的转录水平差异；(4)根据步骤(3)的RT-PCR检测结果，筛选添食核型多角体病毒后BmIML-2基因转录水平显著上调的品种及个体所产蚕卵留种继代；(5)重复步骤(1)至步骤(4)，对继代的家蚕品种进行重复筛选6代以上，获得家蚕核型多角体病毒病抗性品种。优选的，步骤(1)中选取的家蚕品种为波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB和菁松。优选的，步骤(1)中核型多角体病毒溶液的浓度为1×106-5×107个/mL。优选的，步骤(3)中所述的引物序列为：F(SEQIDNO.1)：5’-AGAGTTCGTGTGGCATCTA-3’，R(SEQIDNO.2)：5’-ACCATATGAGAGGCAGGGTT-3’。优选的，步骤(3)中所述组织为脂肪体。优选的，步骤(3)中RT-PCR检测的内参基因选用BmGAPDH基因。优选的，验证步骤(5)获得的家蚕品种核型多角体病毒病抗性：将留种继代的蚕卵催青、饲养至2龄起蚕，然后添食核型多角体病毒，继续饲养至4龄起蚕后统计生存率。优选的，以下家蚕品种：波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB对核型多角体病毒的抗性比菁松提高了10-100倍。本专利技术所述方法设计的原理/思路在于：C型凝集素作为一类重要的模式识别受体，在昆虫启动自身天然免疫反应、杀灭和清除外源病原物过程中发挥着关键作用。BmIML-2作为一种C型凝集素基因，在家蚕脂肪体中转录水平最高，且在添食多角体病毒后转录水平显著上调，表明其在家蚕识别和抵御外源病毒侵染过程中发挥着重要作用。因此，本专利技术将其作为家蚕核型多角体病毒病抗性的检测指标，对核型多角体病毒高抗性品种进行筛选。本专利技术所述方法在上蔟前最后一次给桑时添食BmNPV，并以BmIML-2基因的转录水平为检测指标，判断家蚕对病毒的抗性强弱。另外，上蔟前添毒具有实验周期短、工作量小、易于操作的优点，家蚕化蛹后已不再排便，因此可以有效避免过早添食病毒所造成的交叉污染；此外，成蛾制种后进行取样检测，此时蚕蛾已经交配产卵，完成制种，为继续选育核型多角体病毒抗性品种留下蚕种。通过RT-PCR技术检测BmIML-2基因在家蚕各品种及个体中的转录水平差异，易于操作且便捷稳定。以BmIML-2基因转录水平作为检测指标，对添食多角体病毒后的家蚕品种抗性强弱具有较好的指示作用，因此可对抗性较强的品种进行有效选择。有益效果：(1)本专利技术所述方法选择5龄期上蔟前添毒，能够缩短试验周期，工作量小，且减少家蚕之间相互交叉感染的几率；(2)本专利技术所述方法筛选后的家蚕品种对BmNPV的抗性提高10-100倍；(3)本专利技术所述方法筛选后的家蚕品种经多代饲养抗性稳定，体质强健。附图说明图1是通过RT-PCR检测BmIML-2基因在家蚕不同组织中的转录水平差异图，其中，1：头部，2：中肠，3：脂肪体，4：丝腺，5：马氏管，6：表皮，7：气管；图2是通过RT-PCR检测在家蚕BmIML-2基因在若干家蚕品种中添食BmNPV前后的转录水平差异图，其中，1：波照，2：白玉C3VR6，3：白玉CB，4：PAB，5：菁松。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1通过RT-PCR检测BmIML-2基因在幼虫各组织中的转录水平差异提取家蚕5龄第3天幼虫的头、中肠、脂肪体、丝腺、马氏管、表皮和气管各组织的RNA，并反转录获得cDNA。以反转录获得的cDNA为模板，设计特异性引物，其中正向引物(SEQIDNO.1)：5’-AGAGTTCGTGTGGCATCTA-3’，反向引物(SEQIDNO.2):5’-ACCATATGAGAGGCAGGGTT-3’。家蚕BmGAPDH基因作为内参基因，其上下游引物序列为F(SEQIDNO.3)：5’-TTCATGCCACAACTGCTACA-3’，R(SEQIDNO.4)：5’-AGTCAGCTTGCCATTAAGAG-3’，检测BmIML-2基因在家蚕幼虫不同组织中的转录水平差异(如附图1所示)。实施例2对若干家蚕品种进行添食核型多角体病毒处理并检测BmIML-2转录水平变化在家蚕幼虫上蔟前一次给桑时，以若干家蚕品种为实验材料，分别将各个品种均分为两组进行处理。处理组添食核型多角体病毒(浓度1×107个/mL)浸透后的新鲜桑叶，对照组喂食未浸泡病毒的新鲜桑叶。添毒后及时淘汰病死蚕，直至上蔟结茧，并淘汰病死蛹，分雌、雄对号交配制种。取发蛾制种后的各组蚕蛾，提取脂肪体RNA并反转录获得cDNA。设计特异性引物(同实施例1)，以反转录获得的cDNA为模板，检测家蚕BmIML-2基因在上述家蚕品种中添毒前后的转录水平差异。检测结果如附图2所示，波照、白玉C3VR6、白玉CB以及PAB品种在添食病毒后，BmIML-2转录水平显著上升；菁松品种添食病毒前后BmIML-2转录水平则没有明显差异。实施例3对添食病毒后BmIML-2转录本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)选取至少一个家蚕品种为试验材料并饲养至5龄期；采用家蚕核型多角体病毒“BmNPV”溶液浸泡新鲜桑叶；/n(2)待上蔟前最后一次给桑时，向每个品种的家蚕幼虫添食步骤(1)的桑叶，然后继续饲养直至上蔟结茧，期间淘汰病死蛹，发蛾后制种；/n(3)取步骤(2)制种的蚕蛾，提取组织中的RNA并反转录为cDNA，根据BmIML-2基因全长序列设计引物，以cDNA为模板，通过RT-PCR检测家蚕BmIML-2基因在每个家蚕品种中的转录水平差异；/n(4)根据步骤(3)的RT-PCR检测结果，筛选添食BmNPV后BmIML-2基因转录水平显著上调的品种及个体所产蚕卵留种继代；/n(5)重复步骤(1)至步骤(4)，对继代的家蚕品种进行重复筛选6代以上，获得家蚕核型多角体病毒病抗性品种。/n

【技术特征摘要】
1.利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)选取至少一个家蚕品种为试验材料并饲养至5龄期；采用家蚕核型多角体病毒“BmNPV”溶液浸泡新鲜桑叶；
(2)待上蔟前最后一次给桑时，向每个品种的家蚕幼虫添食步骤(1)的桑叶，然后继续饲养直至上蔟结茧，期间淘汰病死蛹，发蛾后制种；
(3)取步骤(2)制种的蚕蛾，提取组织中的RNA并反转录为cDNA，根据BmIML-2基因全长序列设计引物，以cDNA为模板，通过RT-PCR检测家蚕BmIML-2基因在每个家蚕品种中的转录水平差异；
(4)根据步骤(3)的RT-PCR检测结果，筛选添食BmNPV后BmIML-2基因转录水平显著上调的品种及个体所产蚕卵留种继代；
(5)重复步骤(1)至步骤(4)，对继代的家蚕品种进行重复筛选6代以上，获得家蚕核型多角体病毒病抗性品种。


2.根据权利要求1所述的利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中选取的家蚕品种为波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB和菁松。


3.根据权利要求1所述的利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中BmNPV溶液的浓度为1×10...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵巧玲，沈东旭，郭际云，佟美金，夏定国，裘智勇，沈兴家，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32