基于双链DNA肽连接酶的JAK2基因特定突变检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种基于双链DNA肽连接酶的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变检测试剂盒及方法，是在指数扩增前就直接先对目标基因突变片段进行捕获富集，然后再对目标基因突变片段进行特异性扩增和检测的。JAK2基因g.[146452_146455delATGA]检测试剂盒主要包括：dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶缓冲液，RNase H酶，磁载多肽Ps，RNA引物Pr，DNA引物Pn，DNA片段Pd和DNA引物Pm，其中dDPlaseII连接酶其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；检测方法主要包括前扩增、RNase H酶消化、dDPlaseII酶连接和磁珠分离、特异性扩增这4部分。本发明专利技术提供的检测试剂盒和检测方法，具有特异性强和准确高效、简便经济的特点，可以有效检测出样本中含量低至1%的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变，可以应用于男性结直肠癌患者肺转移的预测和诊治中。

Detection kit and method for specific mutations of JAK2 gene based on double stranded DNA peptide ligase

【技术实现步骤摘要】
基于双链DNA肽连接酶的JAK2基因特定突变检测试剂盒及方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于双链DNA肽连接酶的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
基因是生物体的遗传物质，由其表达的蛋白质承担着生物体内的各项生命机能。基因发生变异或突变将导致生物体出现不同的生物特性或疾病状态。基因突变是基因在其分子结构上发生的核苷酸组成或排列顺序的改变，主要包括点突变、移码突变、缺失突变和插入突变这四种。基因突变和肿瘤的发生发展密切相关。目前，肿瘤已成为全世界范围内发病率和致死率最高的疾病。根据国家癌症中心2019年发布的数据显示，我国2015年新发癌症病例约392.9万例（平均每天超过1万人被确诊为癌症），死亡人数约233.8万例；近10多年来，我国癌症发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持约2.5％的增幅，给国人的生命健康造成了重大的威胁和沉重的负担。在癌症诊治过程中常采用的血清肿瘤标志物和CT等检测手段具有局限性，首先其敏感性和特异性均不高，其次发现有异常时往往已是中晚期，最关键的是无法准确反映出癌灶的分子特征。癌症是一种基因疾病，其发生发展过程中涉及了各种基因突变，它是一个多基因突变累积的过程。因此解析癌症样本中存在的基因突变尤其是驱动基因等关键基因的特定突变，才能从分子本质上体现癌症的真实状况，这对于探究癌症的发生发展机制和预测癌症的发展变化，对于癌症的筛查和诊断，对于癌症的用药和治疗等方面都具有重要的意义。然而在癌症样本中，癌灶部分往往只占检材中的一部分，并且发生特定基因突变的癌细胞也只是癌灶中的一部分（癌灶的异质性），即癌症检测样本中常常存在着大量的野生型基因，尤其是在早癌样本中突变基因只占微小的比例，因此要从中准确有效地检测出特定的基因突变将具有很大的挑战性。目前有多种分子技术可用于癌症基因突变的检测，如PCR-Sanger测序法、实时荧光定量PCR、扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）、数字PCR、变性高效液相色谱法（D-HPLC）以及二代测序（NGS）等方法。其中多数是基于PCR的方法，然而常规PCR扩增时无法区分野生型基因和突变基因，必需进行特定的设计或解析。如常规应用的PCR-Sanger测序法，就是扩增出特定基因片段，然后进行Sanger测序，利用测序峰图来分析特定基因位点的突变情况；再如商品化的ARMS技术，就是设计针对特定基因突变的扩增引物和检测探针，来实现特定基因突变的特异扩增和检测的；再如非常热门的二代测序技术，就是首先无区分地扩增特定基因片段，再利用二代测序超高通量的并行测序能力测出所有扩增基因片段，最后解析其中的突变。本专利技术借助于申请人前期研究获取的双链DNA肽连接酶dDPlaseII（详见申请人之前提交的专利技术专利申请：一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法，申请号：2020100773289），提出了一种特定基因突变的检测新方法，与现有方法不同的是本专利技术方法是在指数扩增前，先利用dDPlaseII酶连接和磁珠法直接对目标基因突变片段进行捕获富集，然后再对目标基因突变片段进行特异性扩增和检测的。这是一种全新的特定基因突变检测方法，具有特异性强和准确高效、简便经济的特点。基于此，本专利技术将其应用于JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测，提供了具体的检测试剂盒及其检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供了基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测试剂盒及其对应的检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的目的之一在于提供一种基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测试剂盒，其主要组分包括：（1）dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，对应的基因编码序列如SEQIDNO：2所示；（2）dDPlaseII连接酶缓冲液，由pH为7.8的450mMTris-Hcl、100mMMg2+、80mMNaCl、20mMATP和8mMTritonX-100组成，每1μl反应体系中添加0.1μl的连接酶缓冲液；（3）RNaseH酶，采用美国ThermoFisher公司产品，包括其配套的缓冲液；（4）磁载多肽Ps，其中多肽Ps的氨基酸序列为N’-EAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGMANCEHL-C’，其N端氨基酸E需要进行生物素修饰；（5）RNA引物Pr，其序列为5’-AUUUACAUUAUUGUUCCAGCAUU-3’；（6）DNA引物Pn，其序列为5’-CATTGACTGGAGGAAATTGAG-3’；（7）DNA片段Pd，其序列为5’-AATGCTGGAACAATAATGTAAAT-3’；（8）DNA引物Pm，其序列为5’-CTGGATCATATAGATCTGTAAAG-3’。其中，试剂盒组分（4）即磁载多肽Ps的主要制备步骤为：1）取0.1ml磁珠按照链霉亲和素磁珠产品说明书中方法进行磁珠的准备，用15ml的离心管装载，采用磁珠产品中自带的缓冲液，最终得到10ml工作液状态下的磁珠液；2）往1）中的磁珠液中加入10mmol/l的多肽Ps溶液0.1ml，采用垂直旋转混匀仪室温下保持充分混匀10min；3）借助磁力架并用缓冲液洗涤已包被多肽的磁珠3次，去除未结合物质，之后加入适量超纯水进行重悬，则可得到磁载多肽Ps悬液。除了本专利技术试剂盒各组分外，JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测还需要一些常规通用组分，如TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、dNTPmix等，可以自行采备。本专利技术的目的之二在于提供一种基于特定双链DNA肽连接酶dDPlaseII的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测方法，即采用上述试剂盒进行JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变检测的检测方法，其主要包括如下步骤：（1）前扩增以提取的待测样本基因组DNA为模板，采用RNA引物Pr和DNA引物Pn对JAK2基因目标片段进行前扩增富集，所得到的产物为前扩增产物，具体扩增体系为：1μl的10×PCRBuffer（Mg2+plus），1μl的dNTPmix（each10mM），1μl的引物Pr(1μmol/l)，1μl的引物Pn(1μmol/l)，0.1μl的TaqDNA聚合酶(5U/μl)，1μl的DNA模板（>50ng/μl），最后再用灭菌无RNA酶超纯水补足至总体积为10μl；具体扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，50℃退火20s，72℃延伸30s，循环10次；72℃终延伸1min。（2）RNaseH酶消化采用RNaseH酶消化前扩增产物中的RNA单链区，使其暴露出突变区域即dDPlaseII酶识别区，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测试剂盒，其特征在于试剂盒的主要组分包括：（1）dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO：2所示；（2）dDPlaseII连接酶缓冲液，由pH为7.8的450mMTris-Hcl、100mM Mg

【技术特征摘要】
1.一种JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测试剂盒，其特征在于试剂盒的主要组分包括：（1）dDPlaseII连接酶，dDPlaseII连接酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，对应的基因编码序列如SEQIDNO：2所示；（2）dDPlaseII连接酶缓冲液，由pH为7.8的450mMTris-Hcl、100mMMg2+、80mMNaCl、20mMATP和8mMTritonX-100组成，每1μl反应体系中添加0.1μl的连接酶缓冲液；（3）RNaseH酶，采用美国ThermoFisher公司产品，包括其配套的缓冲液；（4）磁载多肽Ps，其中多肽Ps的氨基酸序列为N’-EAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGMANCEHL-C’，其N端氨基酸E需要进行生物素修饰；（5）RNA引物Pr，其序列为5’-AUUUACAUUAUUGUUCCAGCAUU-3’；（6）DNA引物Pn，其序列为5’-CATTGACTGGAGGAAATTGAG-3’；（7）DNA片段Pd，其序列为5’-AATGCTGGAACAATAATGTAAAT-3’；（8）DNA引物Pm，其序列为5’-CTGGATCATATAGATCTGTAAAG-3’。


2.根据权利要求1所述的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测试剂盒，其特征在于试剂盒组分（4）即磁载多肽Ps的主要制备步骤为：1）取0.1ml磁珠按照链霉亲和素磁珠产品说明书中方法进行磁珠的准备，用15ml的离心管装载，采用磁珠产品中自带的缓冲液，最终得到10ml工作液状态下的磁珠液；2）往1）中的磁珠液中加入10mmol/l的多肽Ps溶液0.1ml，采用垂直旋转混匀仪室温下保持充分混匀10min；3）借助磁力架并用缓冲液洗涤已包被多肽的磁珠3次，去除未结合物质，之后加入适量超纯水进行重悬，则可得到磁载多肽Ps悬液。


3.如权利要求1或2所述的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变的检测试剂盒对应的检测方法，其特征在于所述检测方法主要包括如下步骤：
（1）前扩增
以提取的待测样本基因组DNA为模板，采用RNA引物Pr和DNA引物Pn对JAK2基因目标片段进行前扩增富集，所得到的产物为前扩增产物，具体扩增体系为：1μl的10×PCRBuffer（Mg2+plus），1μl的dNTPmix（each10mM），1μl的引物Pr(1μmol/l)，1μl的引物Pn(1μmol/l)，0.1μl的TaqDNA聚合酶(5U/μl)，1μl的DNA模板（>50ng/μl），最...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志玲，黄种山，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：福建晨欣科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35