一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法技术

本发明专利技术属于干细胞芯片技术领域，具体涉及一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法。该制备方法包括如下步骤：S1细胞爬片的制备分别将6种口腔干细胞的单细胞悬液接种于细胞基片的各分区框内培养至细胞贴在细胞基片上，随后加入培养基覆盖；取出细胞爬片，用冲洗液冲洗后固定、重溶得6种口腔干细胞细胞悬液；S2细胞芯片的制备将6种口腔干细胞细胞悬液与点样液混合后加入到标准细胞培养板中进行点样后培养，即可制成；其中，所述6种口腔干细胞为DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs。本发明专利技术提供的制备方法制得的细胞芯片具有稳定性好、可重复性好、检测准确性高的优点。

A method of chip preparation based on oral stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法
本专利技术属于干细胞芯片
，具体涉及一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法。
技术介绍
成体细胞由于其无伦理特性以及可自体提取和移植的特点，被广泛研究。而口腔组织由神经嵴分化而来，组织中分离得到的干细胞，不仅具有成体干细胞的优点，还具成神经样细胞的特点，而且还具有免疫原性低的优点，成为应用于临床的良好材料。牙髓干细胞(DPSCs)被从成年人第三磨牙DPSCs在Eagle’s培养基中显示成纤维样细胞形态，集落形成的发生率比骨髓干细胞(BMSCs)更高，表明在牙髓来源干细胞比骨髓来源干细胞有更好的生长潜力。从7-8岁儿童身上收集正常脱落的门牙，分离组织，消化后将单细胞悬液放置于常规培养基中培养，并将由并得到的细胞并为脱落并牙干细胞(SHED)。第三磨牙的根尖并头中分离出具有干细胞特性的细胞群，与载体羟基磷灰石/磷酸钙(HA/TCP)结合后，实现了免疫缺陷小鼠的牙本质再生，他们将这种细胞群并为根尖并头干细胞(SCAP)。牙周膜中分离得到的单细胞悬液，能够表达MSC标志物，在特殊培养条件下分化成牙本质细胞，脂肪细胞和胶原细胞，并且在移植后能够帮助啮齿修复牙周，于是他们将其命名为牙周膜干细胞(PDLSCs)。人牙囊组织中提取细胞，成功分离后，发现其IGF-2比hMSC中表达高100多倍，得到牙囊干细胞(DFSCs)。人牙龈组织中有着MSC细胞成为GMSCs。牙胚组织分离得到新的干细胞，被命名为牙胚细胞(TGPCs)。通过手术从6-44岁患者体内获得牙槽骨，分离得到牙槽骨干细胞(ABMSCs)。众所周知，中国人的口腔问题很严重。人们不健康的生活及卫生习惯导致日常生活中常有牙周炎、牙龈出血、龋齿、口腔溃疡等状况。由于牙齿干细胞的优秀的成牙本质细胞特性，常常被作为一种牙科组织工程的再生材料。口腔是一个复杂的环境，炎性反应以及微生物的存在，让口腔细胞受到多种刺激从而具有一些优良的功能比如抑制微生物生长。牙科干细胞也可以被用作一种疾病药物测试的模型。另外，由于从组织中原代分离得到的细胞是一个高度异质性的混合细胞群，干细胞来源的稳定性直接限制了其应用。相对应的，干细胞膜表面标志物的研究的开展能有效解决这个问题。但是来源于口腔中不同部位、不同组织的干细胞不论是在标志物表征还是在功能特性方面，依然具有比较大差异。现有研究是直接将干细胞单独分离后，分别研究或者进行平行研究，这导致结果的稳定性差，可重复性差。且单独分离细胞培养，因为细胞不能随时保存，有分化、老化甚至细胞死亡的风险，所以每次检测一种细胞基础数据指标，都需要从头开始繁琐的细胞实验操作，每种细胞逐项指标检测，不仅耗费大量时间，还浪费大量试剂。需要一种集合了多种口腔干细胞的微型化的、高效的多细胞平台，去除细胞实验组别的差异，在同一系统中进行干细胞分化、表征、异质性以及药物测试等研究。细胞芯片技术是在一张载玻片上检测数十或上百个病人样本，与各种生物检测技术结合可以低成本高效率地检测多种疾病指标。但截止目前，还仍未见有任何关于口腔干细胞芯片的相关报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法，其包括如下步骤：S1细胞爬片的制备分别将6种口腔干细胞的单细胞悬液接种于细胞基片的各分区框内培养至细胞贴在细胞基片上，随后加入培养基覆盖；取出细胞爬片，用冲洗液冲洗后固定、重溶得6种口腔干细胞细胞悬液；S2细胞芯片的制备将6种口腔干细胞细胞悬液与点样液混合后加入到标准细胞培养板中进行点样后培养，即可制成；其中，所述6种口腔干细胞为DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs。优选地，步骤S1中所述细胞基片为三维基片，其中由固相基片表面修饰一层极薄的含活化醛基的三维结构高分子聚合物。优选地，所述制备方法中采用的培养基为含有10％胎牛血清和1％的青/链霉素双抗的α-MEM培养基。优选地，步骤S1中6种口腔干细胞的单细胞悬液经由如下步骤制得：分别培养6种口腔干细胞待生长至80-90％亚汇合状态，用胰酶消化细胞，培养液吹打后转移到离心管，离心去掉上层培养液，加入新鲜培养基重悬沉淀得6种口腔干细胞的单细胞悬液。优选地，步骤S1中固定所使用的固定液为4％多聚甲醛，固定时间为15-30min。优选地，步骤S2中标准细胞培养板为384孔。优选地，步骤S2中口腔干细胞细胞悬液与点样液混合时的比例为1：1-3。优选地，步骤S2中芯片点样湿度40-50％，进一步优选为50％；洗针条件为超纯水流洗10S、超声10S、抽干10S，共4个循环。优选地，步骤S1中所述的细胞基片在接种之前进行如下处理：将均匀分区后的细胞基片依次用水洗、浓酸浸泡、水洗后湿法灭菌。进一步优选地，所述浓酸为浓盐酸或者浓硫酸，浓度为12mol/L。进一步优选地，浓酸浸泡的时间为5-10min。优选地，步骤S2点样仪的参数设置为：300mm，40个预点样，单矩阵内为6×10，包含每个样点10个，多矩阵为2×3。优选地，步骤S2中所述点样液为基因芯片点样液购于博奥生物有限公司公司，货号440010，规格5ml。本专利技术中步骤S3所得细胞芯片在检测时可进行如下操作：复温芯片，加入分别加入染色剂进行染色，再加上封片剂，4℃避光过夜；PBS洗片3次后晾干，置于荧光显微镜下观察。其中染色剂为CD34-FITC、CD146-FITC中的一种。与现有技术相比，本专利技术提供的制备方法制得的细胞芯片具有如下有益效果：(1)微型化，本专利技术将6种口腔干细胞样本设计放在一种微型的固相载体上。(2)时效性，和经典的流式细胞术检测表面标志物的表达相比，本专利技术能够长期保存，通过交联处理的细胞-20℃能保存3个月，-80℃能够保存半年。流式细胞术则需要新消化的细胞；(3)经济性，本专利技术涉及的细胞爬片和细胞芯片，只需要少量细胞即可在同一个固相平台检测多种指标，不仅节省细胞样本的使用，也很大程度节省了昂贵的抗体试剂；(4)便捷性，一旦制作完成，不需要重新复苏细胞传代等繁琐流程，直接复温后即可使用。(5)本专利技术提供的细胞芯片还具有稳定性好、可重复性好、检测准确性高的优点。附图说明附图1是本专利技术提供的口腔干细胞芯片的结构示意图附图2是本专利技术提供的口腔干细胞芯片的又一结构示意图；附图3口腔干细胞爬片的示意图；附图4是实施例1中口腔干细胞DFSC和SCAP用CD146-FITC的染色结果图；附图5是实施例1中口腔干细胞DFSC和SCAP用CD34-FITC的染色结果图；附图6是对比例中用流式细胞术检测DFSC和SCAP的表面标志物CD146和CD34的结果图；附图7是显微镜下观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法，其包括如下步骤：/nS1细胞爬片的制备/n分别将6种口腔干细胞的单细胞悬液接种于细胞基片的各分区框内培养至细胞贴在细胞基片上，随后加入培养基覆盖；/n取出细胞爬片，用冲洗液冲洗后固定、重溶得6种口腔干细胞细胞悬液；/nS2细胞芯片的制备/n将6种口腔干细胞细胞悬液与点样液混合后加入到标准细胞培养板中进行点样后培养，即可制成；/n其中，所述6种口腔干细胞为DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法，其包括如下步骤：
S1细胞爬片的制备
分别将6种口腔干细胞的单细胞悬液接种于细胞基片的各分区框内培养至细胞贴在细胞基片上，随后加入培养基覆盖；
取出细胞爬片，用冲洗液冲洗后固定、重溶得6种口腔干细胞细胞悬液；
S2细胞芯片的制备
将6种口腔干细胞细胞悬液与点样液混合后加入到标准细胞培养板中进行点样后培养，即可制成；
其中，所述6种口腔干细胞为DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs。


2.根据权利要求1所述的制备方法，步骤S1中所述细胞基片为三维基片，其中由固相基片表面修饰一层极薄的含活化醛基的三维结构高分子聚合物。


3.根据权利要求1所述的制备方法，所述制备方法中采用的培养基为含有10％胎牛血清和1％的青/链霉素双抗的α-MEM培养基。


4.根据权利要求1所述的制备方法，步骤S1中6种口腔干细胞的单细胞悬液经由如下步骤制得：分别培养6种...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷童，杜宏武，
申请(专利权)人：康妍葆北京干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11