一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法技术

本发明专利技术公开了一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，该方法以植物叶片为材料，通过调整材料类型、材料用量、研磨方式、离心转子类型、蛋白重悬方式等过程，结合差速离心方法，得到了高质量的植物叶片内质网蛋白。采用15天左右的适龄植物叶片，新鲜叶片直接加缓冲液研磨的方式取代液氮研磨后超声提取的方式，并且在12000xg转速离心时以水平转子代替定角转子，纯化后内质网蛋白与总蛋白相比，内质网蛋白阳性标记GRP78和CNX，分别上升了约3.3倍和6.1倍，叶绿体阳性蛋白RCA和细胞核阳性蛋白Histone H3分别下降了约84.1％和74.4％。本发明专利技术首次建立一套适用于植物叶片内质网蛋白提取纯化的有效体系，对于其他植物叶片构建内质网蛋白提取纯化体系具有参考意义。

An effective method to extract and purify endoplasmic reticulum and its protein from plant leaves

【技术实现步骤摘要】
一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法
本专利技术涉及一种提取纯化植物叶片内质网及其蛋白的有效方法，适用于植物叶片内质网蛋白的分离纯化，属于植物生物

技术介绍
内质网是一个连续的膜系统，由滑面内质网和附着有核糖体的粗面内质网组成(Wangetal.,2016)。它的主要功能是参与细胞中蛋白质和脂质的生物合成，也是蛋白质的质量控制中心(Borgeseetal.,2006)。现代研究表明在大豆(Wangetal.,2016)、菠菜(Andersonetal.,1994)、拟南芥(Liuetal.,2007)等植物中，内质网都具有重要功能，它能够响应干旱、淹水、寒冷、盐等非生物胁迫，减轻植物受到的伤害。目前从植物叶片中提取内质网未见报道。前期研究表明，在紫外线B(UVB)胁迫后的桑叶亚细胞结构发生显著变化，蛋白质组学研究表明初生代谢系统和次生代谢系统都受到影响(虞姣姣等，2016)。因此提取高质量桑叶内质网以进行内质网蛋白质组学分析，成为进一步开展植物叶片抗UVB胁迫机制等研究工作的关键。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种提取纯化植物叶片内质网及其蛋白的有效方法，用于植物叶片内质网蛋白的分离纯化。本专利技术采用以下技术方案实现：一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，具体包括如下步骤：1.植物叶片的组织破碎(1)称取适量新鲜植物叶片，用清水洗净擦干，得到可以用于后续实验的干净植物叶片；(2)取上述组织叶片，将其剪碎为0.2～2.0cm，置预冷的研钵中，每1g叶片加1-5mL预冷的研磨缓冲液和1-10μL100x的蛋白酶抑制剂，于冰上研磨成匀浆。2.对上述植物叶片的组织匀浆进行离心分离内质网(1)取上述植物叶片匀浆，分装于15mL离心管中，在0-10℃条件下以800-1200xg转速离心10-30分钟，细胞碎片和细胞核在沉淀中，收集上清液；(2)将上述上清液分装至干净并预冷的聚碳酸酯材质的厚壁超速离心管(或同等离心管)，在超速冷冻离心机中，0-10℃条件下以10000-15000xg转速离心10-30分钟，线粒体和叶绿体等细胞器在沉淀中，收集上清液；(3)将上述上清液分装至干净并预冷的聚碳酸酯材质的厚壁超速离心管(或同等离心管)，在超速冷冻离心机中，在0-10℃条件下以60000-150000xg转速离心30-120分钟，去掉上清液，取沉淀即为内质网。3.对上述提取的内质网进行裂解提取蛋白(1)裂解液现用现配，在每5mLRIPAlysis中加入50μL100xPMSF既得；(2)在沉淀中加入200-500μL裂解液，用洗净并预冷的匀浆杵在离心管中将沉淀研磨、重悬以裂解，将重悬液吸出至干净并预冷的1.5或2mL离心管中；(3)加入约30-100μL裂解液冲洗离心管和匀浆杵，汇总到重悬液中即得到植物叶片内质网蛋白，置于-80℃保存或立即进行检测。4.对上述所得内质网蛋白进行纯度检测利用内质网蛋白与总蛋白的蛋白印迹实验(Westernblot)条带的相对强度比较来进行纯度检测。(1)实验前进行植物叶片总蛋白提取：称取适量新鲜植物叶片，每0.5g加入3mL裂解液，于冰上研磨成匀浆状，用100μm细胞筛过滤匀浆，收集滤液即为植物叶片总蛋白；(2)蛋白定量和样品制备：利用BCA试剂盒方法进行蛋白浓度测定，用裂解液和5xloadingbuffer将各蛋白稀释至相同浓度，于100℃加热15分钟，短暂离心后取上清即为样品溶液；(3)SDS-PAGE电泳作为上样对照：参照SDS-PAGE电泳方法，ER和TP蛋白上样量为20ug，在恒定电压80～100V下进行电泳至染料到达底部，再对凝胶进行银染和成像，确定上样量接近。(4)Westernblot实验方法查看条带相对强度：按照上述(3)中的上样量，进行Westernblot实验，利用GRP78和CNX作为内质网蛋白阳性标记，RCA作为叶绿体蛋白阳性标记，HistoneH3作为细胞核蛋白阳性标记。扫描得到电子版条带，利用ImageJ软件进行灰度值分析，利用SPSS软件进行统计学分析。本专利技术中，所述的植物叶片为桑叶、铁线莲叶或十大功劳的叶片。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种提取植物叶片内质网及其蛋白质的方法，具有以下优点：(1)为了避免匀浆质地粘稠难以研磨均匀，同时能够去除细胞核蛋白污染，我们选用从发芽开始15天左右的适龄植物叶片作为实验材料，有效保证了内质网的完整性；(2)用新鲜叶片直接加缓冲液研磨的方式取代液氮研磨后冰上超声的方式，大大提高了提取得到的产物含量；(3)在12000xg转速离心时选择水平转子，而不是定角转子，有效去除了叶绿体蛋白的污染；(4)采用玻璃匀浆杵直接在离心管中裂解沉淀再吸出重悬液的方法，解决了超速离心管中沉淀难以转移的困扰，并且加快了蛋白提取效率，减少蛋白降解。本专利技术首次建立一套适用于植物叶片(包括桑叶、铁线莲叶或十大功劳的叶片)内质网蛋白提取纯化的有效体系，对于其他的植物叶片构建内质网蛋白提取纯化体系具有参考意义。本专利技术可以解决植物叶片内质网研究技术的难题，有效地从植物叶片中提取得到高质量的内质网蛋白。经纯化后植物叶片内质网蛋白与总蛋白相比，内质网蛋白阳性标记GRP78和CNX均显著高于总蛋白，分别上升了约3.3倍和6.1倍，说明内质网蛋白得到显著富集；叶绿体阳性蛋白RCA和细胞核阳性蛋白HistoneH3在内质网蛋白中都显著低于总蛋白，分别下降了约6.3倍和3.9倍，说明污染细胞器得到了有效去除。按照此方法提取得到的植物叶片内质网蛋白可用于进一步研究。附图说明图1：内质网蛋白和总蛋白上样对照图；图2：内质网和总蛋白的蛋白印迹条带图；图3：蛋白印迹条带的灰度值统计学分析图(*p<0.05，**p<0.01，n＝3)。具体实施方式以下结合符合和具体实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术实施例以桑叶为例对该方法作进一步描述。本研究所用桑叶(MorusalbaL.)盆栽苗购买自杭州格桑园艺有限公司，在浙江大学紫金港校区温室(气温28-30℃；相对湿度70-80％；白光辐照度160μmolm-2s-1)中生长。本专利技术所用的常用试剂和试剂盒例如PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、银染试剂盒等均购于杭州汤普科技有限公司；桑叶研磨缓冲液及蛋白酶抑制剂购自美国NOVUS公司；抗体GRP78、RCA、HistoneH3购买自杭州华安生物技术有限公司，CNX购买自瑞典Agrisera公司。具体配制方法如下：1.研磨及离心所用试剂研磨缓冲液：5xIsosmoticHomogenizationBuffer(KC-414)，由HEPES、Sucrose、KCl组成。蛋白酶抑制剂：100xProteaseInhibitorCocktail(PIC，KC-121)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)对植物叶片进行组织破碎，并研磨成匀浆；/n2)对植物叶片组织匀浆进行离心分离内质网；/n3)对内质网进行裂解提取蛋白；/n所述的步骤2)具体为：/n(1)将步骤1)得到的植物叶片匀浆分装于离心管中，在0-10℃条件下以800-1200xg转速离心10-30分钟，收集上清液；/n(2)将上述上清液分装至干净并预冷的超速离心管中，在超速冷冻离心机中，0-10℃条件下以10000-15000xg转速离心10-30分钟，收集上清液；/n(3)将上述上清液分装至干净并预冷的超速离心管中，在0-10℃条件下以60000-150000xg转速离心30-120分钟，去掉上清液，取沉淀即为内质网。/n

【技术特征摘要】
1.一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对植物叶片进行组织破碎，并研磨成匀浆；
2)对植物叶片组织匀浆进行离心分离内质网；
3)对内质网进行裂解提取蛋白；
所述的步骤2)具体为：
(1)将步骤1)得到的植物叶片匀浆分装于离心管中，在0-10℃条件下以800-1200xg转速离心10-30分钟，收集上清液；
(2)将上述上清液分装至干净并预冷的超速离心管中，在超速冷冻离心机中，0-10℃条件下以10000-15000xg转速离心10-30分钟，收集上清液；
(3)将上述上清液分装至干净并预冷的超速离心管中，在0-10℃条件下以60000-150000xg转速离心30-120分钟，去掉上清液，取沉淀即为内质网。


2.根据权利要求1所述的一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，其特征在于，所述的植物叶片为桑叶、铁线莲叶或十大功劳的叶片。

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玮，欧钰婷，田景奎，李守信，刘胜志，钟卓珩，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33