一种同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体及其制备方法与应用，所述制备方法先合成了一种易于转化、细胞内涵体pH响应的聚乙二醇‑b‑聚(2‑(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯高分子材料，再利用该细胞内涵体pH响应的高分子材料构建新型酸敏纳米载体，用于同时输送siRNA和化疗前体药物。本发明专利技术所制备的纳米载体共输送siRNA和prodrug时，能够对内涵体的酸性pH做出响应，加快siRNA和prodrug的胞内释放，沉默化疗耐药相关的靶基因，并增加化疗敏感性，协同杀伤肿瘤细胞。

A novel acid sensitive nano carrier containing both siRNA and cisplatin prodrugs and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药领域，更具体地，本专利技术涉及一种同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体及其制备方法与应用。
技术介绍
化疗是肿瘤治疗的基石，但是化疗药物缺乏靶向性，肿瘤细胞被杀伤的同时正常细胞也会受到极大损害(肝肾功能障碍/骨髓移植等)，这导致部分患者无法耐受化疗副作用而中断治疗。为解决化疗药物缺乏靶向性的问题，有方法提出利用癌驱动相关基因进行治疗。肿瘤细胞中有多种癌驱动相关基因，癌驱动相关基因在肿瘤中相对正常细胞高表达，其与肿瘤的发生/发展，侵袭/转移密切相关。现阶段，针对癌驱动相关基因的药物主要有小分子激酶抑制剂和单克隆抗体，如针对HER2+肿瘤的拉帕替尼和曲妥珠单抗。但对癌驱动相关基因的小分子激酶抑制剂和单克隆抗体药效不高，并且容易造成耐药，制备成本高，患者经济负担重。也有采用白蛋白紫杉醇的技术方案，白蛋白紫杉醇是将白蛋白纳米颗粒作为药物载体，结合紫杉醇的一种纳米化疗药。白蛋白紫杉醇纳米药物具有粒径小、比表面积大、黏附性好的特点，可提高药物的生物利用度，形成较高的局部浓度，从而提高疗效，减少了紫杉醇的毒副作用。并且，因半胱氨酸酸性分泌蛋白(secretedproteinacidicandrichincysteine，SPARC)在肿瘤内富集，而白蛋白可与SPARC结合，此特性使化疗药物更好的靶向于肿瘤区域。SPARC虽然在肿瘤中富集，但特异性不够强(普遍存在于正常组织器官中)，化疗药物毒副作用不可避免。也有采用抗体偶联药物(antibody-drugconjugates，ADCs)的技术方案，抗体偶联药物是将具有靶向性质的抗体和强细胞毒性的药物(主要是化疗药)偶联而成的一种新型抗肿瘤药物，主要由靶向性的抗体、偶联的药物及连接子构成。例如现在针对HER2+乳腺癌的TDM-1,是将人源化抗HER2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab，Herceptin)与高活性抗有丝分裂的美登素衍生物DM1偶联而形成抗体偶联药物。由于DM1具有极强的细胞毒性，未能在临床上使用。曲妥珠单抗则可靶向结合于HER2+乳腺癌细胞，阻断促进肿瘤生长信号，同时也可激活机体免疫系统攻击肿瘤细胞，TDM1可通过其抗体识别、结合并内化进入HER2阳性肿瘤细胞，在肿瘤细胞内解离释放DM1，从而杀灭肿瘤细胞。而在解离前T-DM1无活性，因此避免了传统化疗药物对正常组织的损伤作用。不过，抗体偶联药物连接子不稳定会使得药物的全身暴露，能和表达相同抗体的正常组织结合，存在脱靶效应，并且价格昂贵。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是近年来发展迅速的一种治疗方式，在多种疾病的治疗应用中潜能巨大。和小分子靶向药物相比，siRNA对靶点的选择性会更好，能够特异性结合靶基因并下调靶基因表达，不会影响细胞中其它正常基因的表达。但是RNAi技术在临床转化时最大难题是缺少低毒高效的载体将siRNA输送到病灶部位和细胞内。对于基于RNAi技术的癌症治疗，siRNA在输送过程需要突破一系列生理屏障，例如如何靶向肿瘤细胞、穿透肿瘤组织和细胞膜、从内涵体高效逃逸，以及在细胞质内有效释放siRNA等。虽然使用传统的病毒载体如腺病毒和逆转录病毒传递siRNA可以克服上述各种生理屏障，但那种方式具有制备困难、siRNA容量小、靶向特异性差、免疫原性强等缺点。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体，该新型酸敏纳米载体靶向性强，能够沉默肿瘤化疗耐药基因，增加化疗敏感性，且制备成本低。本专利技术的另一目的在于提供所述同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供所述同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体的应用。本专利技术采取的技术方案如下：一种细胞内涵体pH响应的高分子材料的制备方法，包括如下步骤：S1、溴代聚乙二醇(Meo-PEG-Br)的合成：将聚乙二醇(Meo-PEG-OH)和三乙胺溶于二氯甲烷中，在冰盐浴中，滴加α-溴异丁酰溴，在室温下搅拌反应20～30小时后，分别用氢氧化钠和盐酸水溶液洗涤反应液，最后用去离子洗涤，收集有机相，用无水硫酸镁干燥后，浓缩溶液，加入冷乙醚沉淀出产物，真空干燥后收集白色粉末状产物；其中，聚乙二醇、三乙胺、α-溴异丁酰溴的用量分别为1.5～1.8mmol、8～10mmol、8～10mmol，氢氧化钠和盐酸水溶液的浓度均为0.8～1.2mol/L；S2、聚乙二醇-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(Meo-PEG-b-PDPA)的合成：将10～15mmol2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯((DPA-MA)、0.12～0.18mmol溴代聚乙二醇(Meo-PEG-Br)和0.12～0.18mmolN,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)，加入到聚合管中，然后加入2～5mL二甲基甲酰胺和2～5mL2-异丙醇溶解单体和溴代聚乙二醇，冷冻-解冻除去氧气，在氮气氛下加入0.12～0.18mmolCuBr，并将聚合管真空密封，在38～42℃聚合20～30小时后，加入四氢呋喃稀释产物，然后使用中性三氧化二铝柱除去催化剂CuBr，收集滤液，将滤液转移至透析管中，截留分子量为5000～8000的产物，用去离子水透析，最后真空冷冻干燥产品。本专利技术利用上述制备方法制备得到了一种易于转化、细胞内涵体pH响应的高分子材料——聚乙二醇-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(Methoxyl-polyethyleneglycol-b-poly(2-(diisopropylamino)ethylmethacrylate),Meo-PEG-b-PDPA)，其pKa为6.24，在内涵体pH范围内(6.0-6.5)，后续可将其用于构建酸敏纳米载体。优选地，步骤S1中加入冷乙醚沉淀出产物这一过程是反复沉淀了3次。优选地，步骤S2中除去氧气的过程是冷冻-解冻三次除去氧气。优选地，步骤S2中用去离子水透析为用去离子水继续透析3天。所述的制备方法制备得到的细胞内涵体pH响应的高分子材料聚乙二醇-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯。一种同时载有siRNA和顺铂前药的新型酸敏纳米载体的制备方法，包括如下步骤：(1)化疗前体药物顺铂前药的制备：取一定量的二氯二胺顺铂溶于DMF(二甲基甲酰胺)中，随后向该溶液中加入辛酸酐，在58℃～62℃条件下搅拌反应15～20小时后，滤去沉淀，浓缩滤液，然后加入冷的乙醚沉淀出产品，用乙醚洗涤，最后真空干燥，收集黄色产品化疗前体药物顺铂前药；其中，二氯二胺顺铂、二甲基甲酰胺、辛酸酐的用量分别为0.3～0.5mmol、8～12mL、1.2～1.3mmol。(2)新型酸敏纳米载体的制备：选取DMF作为溶剂，配置浓度为18～22mg/ml的聚乙二醇-b-聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞内涵体pH响应的高分子材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、溴代聚乙二醇的合成：/n将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，在冰盐浴中，滴加α-溴异丁酰溴，在室温下搅拌反应20～30小时后，分别用氢氧化钠和盐酸水溶液洗涤反应液，最后用去离子洗涤，收集有机相，用无水硫酸镁干燥后，浓缩溶液，加入冷乙醚沉淀出产物，真空干燥后收集白色粉末状产物；其中，聚乙二醇、三乙胺、α-溴异丁酰溴的用量分别为1.5～1.8mmol、8～10mmol、8～10mmol，氢氧化钠和盐酸水溶液的浓度均为0.8～1.2mol/L；/nS2、聚乙二醇-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯的合成：/n将10～15mmol 2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、0.12～0.18mmol溴代聚乙二醇和0.12～0.18mmol N,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺加入到聚合管中，然后加入2～5mL二甲基甲酰胺和2～5mL 2-异丙醇溶解单体和溴代聚乙二醇，冷冻-解冻除去氧气，在氮气氛下加入0.12～0.18mmol CuBr，并将聚合管真空密封，在38～42℃聚合20～30小时后，加入四氢呋喃稀释产物，然后使用中性三氧化二铝柱除去催化剂CuBr，收集滤液，将滤液转移至透析管中，截留分子量为5000～8000的产物，用去离子水透析，最后真空冷冻干燥产品。/n...

【技术特征摘要】
1.一种细胞内涵体pH响应的高分子材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、溴代聚乙二醇的合成：
将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，在冰盐浴中，滴加α-溴异丁酰溴，在室温下搅拌反应20～30小时后，分别用氢氧化钠和盐酸水溶液洗涤反应液，最后用去离子洗涤，收集有机相，用无水硫酸镁干燥后，浓缩溶液，加入冷乙醚沉淀出产物，真空干燥后收集白色粉末状产物；其中，聚乙二醇、三乙胺、α-溴异丁酰溴的用量分别为1.5～1.8mmol、8～10mmol、8～10mmol，氢氧化钠和盐酸水溶液的浓度均为0.8～1.2mol/L；
S2、聚乙二醇-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯的合成：
将10～15mmol2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、0.12～0.18mmol溴代聚乙二醇和0.12～0.18mmolN,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺加入到聚合管中，然后加入2～5mL二甲基甲酰胺和2～5mL2-异丙醇溶解单体和溴代聚乙二醇，冷冻-解冻除去氧气，在氮气氛下加入0.12～0.18mmolCuBr，并将聚合管真空密封，在38～42℃聚合20～30小时后，加入四氢呋喃稀释产物，然后使用中性三氧化二铝柱除去催化剂CuBr，收集滤液，将滤液转移至透析管中，截留分子量为5000～8000的产物，用去离子水透析，最后真空冷冻干燥产品。


2.根据权利要求1所述的细胞内涵体pH响应的高分子材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中加入冷乙醚沉淀出产物这一过程是反复沉淀了3次。


3.根据权利要求1所述的细胞内涵体pH响应的高分子材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中除去氧气的过程是冷冻-解冻三次除去氧气。


4.根据权利要求1所述的细胞内涵体pH响应的高分子材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中用去离子水透析为用去离子水继续透析3天。
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【专利技术属性】
技术研发人员：许小丁，张磊，李森林，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东;44