增强的RNA相互作用组捕获(eRIC)制造技术

本发明专利技术涉及检测细胞、组织或生物体中的RNA结合蛋白(RBP)的改进的方法，包括利用在其序列中包含锁核酸(LNA)‑核苷酸类似物的寡核苷酸。

Enhanced RNA interaction group capture (ERIC)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强的RNA相互作用组捕获(eRIC)本专利技术涉及检测细胞、组织或生物体中的RNA结合蛋白(RBP)的改进的方法，包括利用在其序列中包含锁核酸(LNA)-核苷酸类似物的寡核苷酸。
技术介绍
从合成到衰变，RNA结合蛋白(RBP)均与RNA结合，形成称为核糖核蛋白(RNP)的动态复合物。RBP控制RNA的命运，并因此在基因表达中起核心作用。诸如免疫沉淀联合微阵列或下一代测序的技术的实施，使得可以对由单独RBP控制的RNA网络进行更深入的研究。然而，如通过HeLa和HEK293细胞的mRNA相互作用组所判断的，RNA生物学中涉及的蛋白质的范围仍然不清楚，并且似乎在以前被低估了。先前已经使用多种方法研究了RNA相互作用组，即RNA结合蛋白的集合。在两项不同的研究中使用了全基因组原阵列(protoarrays)和荧光RNA探针来系统地鉴定酵母RBP(Scherrer,T.,Mittal,N.,Janga,S.C.&Gerber,A.P.AscreenforRNA-bindingproteinsinyeastindicatesdualfunctionsformanyenzymes.PLoSOne5,e15499(2010)；Tsvetanova,N.G.,Klass,D.M.,Salzman,J.&Brown,P.O.Proteome-widesearchrevealsunexpectedRNA-bindingproteinsinSaccharomycescerevisiae.PLoSOne5(2010))。固定的RNA探针也被用作诱饵，以在体外捕获特异性的RBP，然后进行定量质谱法(Butter,F.,Scheibe,M.,Morl,M.&Mann,M.UnbiasedRNA-proteininteractionscreenbyquantitativeproteomics.ProcNatlAcadSciUSA106,10626-10631(2009))。然而，这些方法并未将由各自多肽的生化特性促进的非生理性RNA-蛋白质相互作用与在活细胞中发生的那些区分开。已使用计算机模拟算法来识别候选RBP，搜索细胞蛋白组中的RNA结合结构域(RBD)或与RNA相关的酶活性(Anantharaman,V.,Koonin,E.V.&Aravind,L.ComparativegenomicsandevolutionofproteinsinvolvedinRNAmetabolism.NucleicAcidsRes30,1427-1464(2002))。这些方法将另外的蛋白质鉴定为潜在的RBP，其与先前已知的RNA结合剂具有相似的结构和功能特征。然而，如最近发表的RNA相互作用组数据集所说明的，这些分析无法识别非常规的RBP(Baltz,A.G.etal.ThemRNA-BoundProteomeandItsGlobalOccupancyProfileonProtein-CodingTranscripts.MolCell46,674-690(2012)；Castello,A.etal.InsightsintoRNABiologyfromanAtlasofMammalianmRNA-BindingProteins.Cell149,1393-1406(2012))。US2013-123123公开了以下方法，其包括：a)利用热稳定的交联剂交联细胞的内容物以产生交联的核糖核苷酸复合物；b)将交联的核糖核苷酸复合物片段化以产生包含蛋白质、RNA片段，以及任选地基因组DNA片段的复合物；c)在包括较高温度在内的高严格性条件下使复合物与包含亲和标签的且与细胞的特异性的靶标RNA互补的多种非重叠的寡核苷酸接触；d)利用亲和标签分离含有寡核苷酸的复合物以产生分离的复合物；e)从分离的复合物酶促释放蛋白质、RNA片段和/或基因组DNA片段，以产生释放的组分，而不逆转交联；以及f)分析所释放的组分。WO2015/191780涉及锌指蛋白CCCTC结合因子(CTCF)RNA相互作用组。WO2016/149455涉及多梳相关的RNA、那些RNA的文库和片段、抑制性核酸和方法及用于靶向RNA的组合物，以及以上的使用方法。WO2009/024781公开了用于分离与靶标核酸序列结合的多肽和多肽复合物的方法。方法包括以下步骤：获得包含靶标核酸序列以及与该靶标核酸序列结合的一种或多种多肽的样品；使样品与包含与至少一部分的靶标核酸序列互补且能够与之杂交的序列的至少一种寡核苷酸探针接触，其中所述寡核苷酸探针包含至少一个锁核酸(LNA)核苷酸，并且其中所述寡核苷酸探针还包含至少一种亲和标签；使所述至少一种寡核苷酸探针与所述靶标核酸序列彼此杂交，以便形成探针-靶标杂合物；通过与至少一种亲和标签结合的分子来固定所述探针-靶标杂合物而从样品分离所述探针-靶标杂合物；以及洗脱与靶标核酸序列结合的一种或多种多肽。还提供了用于筛选方法的探针。US8748354公开了RNA相互作用组分析的方法，包括：a)利用热稳定交联剂交联细胞的内容物以产生交联的核糖核苷酸复合物；b)将交联的核糖核苷酸复合物片段化以产生包含蛋白质、RNA片段和任选地基因组DNA片段的复合物；c)在包括较高温度在内的高严格性条件下使复合物与包含亲和标签的且与细胞的特异性的靶标RNA互补的多种非重叠的寡核苷酸接触；d)利用亲和标签分离含有寡核苷酸的复合物以产生分离的复合物；e)从分离的复合物酶促释放蛋白质、RNA片段和/或基因组DNA片段以产生释放的组分，而不逆转交联；以及f)分析释放的组分。Rogell等人(Rogelletal.“SpecficRNPcapturewithantisenseLNA/DNAmixmers”,RNA,第23卷,编号8,2017年5月5日,第1290-1302页)公开了“特异性的核糖核蛋白(RNP)捕获”——用于确定体外和细胞系统中的与特异性的转录物结合的蛋白质的方法。特异性的RNP捕获使用UV辐照来共价稳定在“零距离”处发生的蛋白质-RNA相互作用。然后通过与共价偶联至磁性树脂上的反义锁核酸(LNA)/DNA寡核苷酸杂交来捕获与靶标RNA结合的蛋白质。在严格洗涤之后，通过定量质谱法确定相互作用的蛋白质。方法揭示出了先前未知的RNA结合蛋白。Beckmann(BenediktM.Beckmann:“RNAinteractomecaptureinyeast”,Methods,第118-119卷,2016,第82-92页)公开了酵母RNA相互作用组捕获方案，其采用RNA标记、RNA和蛋白质在365nm波长处的共价UV交联(可光激活的核糖核苷酸增强的交联，PAR-CL)，以及最终纯化与蛋白质结合的mRNA。Conrad等人(Conradetal.“Serialinteractomecaptureofthehumancellnucleus”,NatureComm.,第7卷,2016年4月4日,第1-11页)公开了“系列RNA相互作用组捕获”(serIC)—本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测细胞、组织或生物体中的RNA结合蛋白(RBP)的方法，其包括：/na)利用合适的辐照使包含RBP的细胞、组织或生物体的内容物共价交联，以产生包含交联的核糖核苷酸复合物的生物物质；/nb)溶解包含所述交联的核糖核苷酸复合物的所述生物物质；/nc)于15℃以上的温度，优选约37-40℃，在合适的条件下，使所述交联的核糖核苷酸复合物与和所述生物物质的至少一种特异性的靶标RNA互补的至少一种寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸在其序列中包含至少一个锁核酸(LNA)-核苷酸类似物，并且其中所述寡核苷酸与合适的固体支持物如磁性颗粒偶联；/nc’)于约40℃，在水中进行严格的预洗脱；/nd)利用所述固体支持物分离包含所述至少一种寡核苷酸的复合物；/ne)从所述分离的复合物酶促释放和/或热洗脱所述RBP和RNA片段，以产生释放的RBP；以及/nf)检测所述释放的RBP。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170818 EP 17186948.01.检测细胞、组织或生物体中的RNA结合蛋白(RBP)的方法，其包括：
a)利用合适的辐照使包含RBP的细胞、组织或生物体的内容物共价交联，以产生包含交联的核糖核苷酸复合物的生物物质；
b)溶解包含所述交联的核糖核苷酸复合物的所述生物物质；
c)于15℃以上的温度，优选约37-40℃，在合适的条件下，使所述交联的核糖核苷酸复合物与和所述生物物质的至少一种特异性的靶标RNA互补的至少一种寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸在其序列中包含至少一个锁核酸(LNA)-核苷酸类似物，并且其中所述寡核苷酸与合适的固体支持物如磁性颗粒偶联；
c’)于约40℃，在水中进行严格的预洗脱；
d)利用所述固体支持物分离包含所述至少一种寡核苷酸的复合物；
e)从所述分离的复合物酶促释放和/或热洗脱所述RBP和RNA片段，以产生释放的RBP；以及
f)检测所述释放的RBP。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述辐照选自例如约254nm或约365nm的UV光。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中在例如包括包含约500mM氯化锂和约0.5％十二烷基硫酸锂的缓冲液的变性条件下，溶解所述细胞。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括在分离所述复合物之前，剪切基因组DNA的步骤。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述预洗脱进行约5至10分钟。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔尔·伊格纳齐奥·佩雷斯佩里，马蒂亚斯·W·亨茨，比吉特·罗格尔，
申请(专利权)人：欧洲分子生物学实验室，
类型：发明
国别省市：德国;DE