单核和单分子染色质相互作用测定制造技术

本发明专利技术提供了一种基于单分子蛋白质检测和DNA测序平台在单分子和单核单分子水平上用于下一代染色质相互作用测定的方法。本发明专利技术具有单核中的单分子分辨率和消除近端连接和PCR扩增步骤的优点。本发明专利技术在3D基因组的组织及其调节方面提供了革命性的生物学见解。

Determination of the interaction between mononuclear and monomolecular chromatin

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单核和单分子染色质相互作用测定相关申请的交叉引用本申请要求2017年6月16日提交的美国临时申请号62/520,665的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本公开总体上涉及三维(3D)基因组组织映射(organizationalmapping)和染色质相互作用的领域。本公开具有在固相上的单分子分辨率和单核分辨率，和消除近端连接和PCR扩增步骤，避免技术噪音的优点。具体地，本公开提供了一组染色质相互作用测定，其可以检测单染色质复合物中和单核中超过两个基因座之间的相互作用。该方法是基于单分子蛋白质检测和商用平台DNA测序。本公开的染色质相互作用测定在3D基因组组织及其调节方面提供了革命性的生物学见解。
技术介绍
人类基因组被广泛折叠成3D蛋白质介导的染色质环，这为基因组功能(包括转录调节)提供了拓扑基础。3D基因组组织的当前知识主要基于来自数百万个细胞的染色质分子的群体水平研究，因此当前视角是许多个体细胞的平均值。尽管这样的观察已揭示了3D基因组组织的原理，但它们未能提供人类基因组如何在个体染色质复合物和个体核中的分子水平折叠的精确视图，从而掩盖了重要的分子动力学和细胞至细胞异质性。例如，先前报道的通过成对末端标记(ChIA-PET)数据进行染色质相互作用测定揭示了多个基因启动子和增强子可以结合在一起以形成复杂的染色质环，启示基因共调控的拓扑机制(Li,G.等Cell(2012)148(1-2):84-98,PMJX>:22265404)；Tang,Z.等Cell(2015)163(7):1611-1627,PMID:26686651)。然而，尚不清楚个体核是否包含这样的多重染色质环或者个体环是否在核之间不同地发生并在整个细胞分析中共同显示为联合成环复合物。这是因为ChIA-PET和其他常用的确定染色质相互作用的技术Hi-C所基于的近端连接和成对末端标签测序只可揭示两个基因座之间的成对染色质相互作用，而不是涉及超过两个基因座的联系关系。对于广泛的基因组结构随机性和转录异质性在表型相同的细胞中的存在的越来越多的证据进一步使我们对更高层次的基因组组织和功能的解释混乱。实际上，在开发单细胞3D基因组映射技术方面已经做出了积极的努力，例如单细胞Hi-C(Nagano,T.,等,Nature(2013)502(7469):59-64,PMID:24067610)。然而，当前基于单细胞分离或个体细胞条形码化的策略继续以依赖于用于DNA操纵的常规分子方法，包括近端连接、DNA扩增和测序文库制备。这样的策略不太可能打破当前对单细胞中染色质相互作用的真正单分子分析的技术障碍。新的技术是迫切需要的。特别需要的是能够识别超过两个基因座之间的相互作用，提供来自单染色质复合物(单分子)的数据，提供来自单核的染色质复合物的单分子数据，并将该数据映射以提供整个基因组中染色质相互作用的视图的染色质相互作用测定。
技术实现思路
本公开提供了一种用于检查单染色质复合物中的染色质相互作用的新技术，包括超过两个染色质基因座之间的相互作用，然后使用来自单染色质复合物的数据以生成染色质相互作用的全基因组地图。本公开提供了一种称为单分子染色质相互作用分析(smChIA)的测定，其可以方便地利用用于单分子蛋白质检测和DNA测序的商业平台。SEQLL是这样的平台的一个实例。在一个方面，本专利技术提供了用于单分子染色质相互作用分析的新型顺序测序方法。具体地，smChIA包括将染色质材料固定到流动池表面上用于单分子蛋白质检测，并对通过每个染色质复合物中的蛋白质束缚在一起的DNA片段进行直接顺序单分子测序。值得注意的是，顺序测序在没有染色质近端连接或DNA扩增的情况下完成。本公开提供了一种用于确定多个蛋白质和RNA因子在每个基因座处的共定位的方法。因此，smChIA具有改变染色质相互作用分析和3D基因组生物学的领域的潜力。本公开提供了smChIA，一种在单分子水平上确定染色质相互作用的方法。SmChIA包括以下步骤：a)交联细胞中的基因组DNA和蛋白质；b)使所交联的基因组DNA片段化以提供染色质复合物，所述染色质复合物包含DNA和一种或多种特定蛋白质；c)将两个或更多个不同的条形码化接头连接至所述染色质复合物中的所述DNA以形成条形码化染色质复合物；d)将所述条形码化染色质复合物固定到表面上；e)使用TIRF显微镜在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物成像；f)在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物中的所述DNA进行顺序地测序以产生多个序列读取结果；和g)将所述多个序列读取结果映射至参比基因组以产生所述测序读取结果的基因组位置以产生3D基因组联系图，其中所述联系图指示所述染色质复合物中存在的所述基因组DNA和蛋白质在单分子水平上的物理相互作用。在将条形码化染色质复合物固定到表面上之前，条形码化染色质复合物可以通过能够结合条形码化染色质复合物中的特定蛋白质的第一抗体而免疫沉淀，从而富集所述染色质复合物用于smChIA分析。成像步骤e)可包括用能够结合条形码化染色质复合物中的特定蛋白质的第二抗体对条形码化染色质复合物进行免疫染色。在成像步骤之后，smChIA方法可包括通过用针对染色质复合物中存在的特定蛋白质的荧光标记抗体进行免疫染色而顺序地检测特定蛋白质。smChIA方法还可包括从染色质复合物中去除蛋白质组分，并保留固定在表面上的染色质复合物的DNA模板。本公开还提供了一种确定单核中的染色质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供单核，所述核包含基因组DNA和蛋白质；b)交联所述核中的基因组DNA和蛋白质；c)使所交联的基因组DNA原位片段化以提供多个染色质复合物，每个染色质复合物包含基因组DNA和一种或多种特定蛋白质；d)将两个或更多个不同的条形码化接头连接至所述染色质复合物中的所述DNA以形成条形码化染色质复合物；e)将所述单核固定到表面上；f)裂解所述单核使得所述核中含有的所述条形码化染色质复合物分散在所述表面上；g)用能够结合所述条形码化染色质复合物中存在的蛋白质的抗体对所述条形码化染色质复合物进行免疫染色；h)使用TIRF显微镜对所免疫染色的条形码化染色质复合物成像；i)重复g)和h)以连续监测两种或更多种抗体；j)在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物进行顺序地测序以产生多个序列读取结果；和1)将所述多个序列读取结果映射至参比基因组以产生所述测序读取结果的基因组位置以产生3D基因组联系图；其中所述联系图指示所述染色质复合物中的基因组DNA和蛋白质在单分子水平上的物理相互作用。在某些实施方式中，可以重复本方法中的步骤g)和h)用于采用两种或更多种抗体的顺序检测。当根据附图和权利要求书阅读时，根据优选的实施方式的以下详细描述，本公开的各种目的和优点对于本领域技术人员将变得明显。附图说明图1是smCh本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定单分子水平上的染色质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：/na)交联细胞中的基因组DNA和蛋白质；/nb)使所交联的基因组DNA片段化以提供染色质复合物，所述染色质复合物包含DNA和一种或多种特定蛋白质；/nc)将两个或更多个不同的条形码化接头连接至所述染色质复合物中的所述DNA以形成条形码化染色质复合物；/nd)将所述条形码化染色质复合物固定到表面上；/ne)使用TIRF显微镜在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物成像；/nf)在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物中的所述DNA进行顺序地测序以产生多个序列读取结果；和/ng)将所述多个序列读取结果映射至参比基因组以产生所述测序读取结果的基因组位置以产生3D基因组联系图，/n其中所述联系图指示所述染色质复合物中存在的所述基因组DNA和蛋白质在单分子水平上的物理相互作用。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170616 US 62/520,6651.一种确定单分子水平上的染色质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：
a)交联细胞中的基因组DNA和蛋白质；
b)使所交联的基因组DNA片段化以提供染色质复合物，所述染色质复合物包含DNA和一种或多种特定蛋白质；
c)将两个或更多个不同的条形码化接头连接至所述染色质复合物中的所述DNA以形成条形码化染色质复合物；
d)将所述条形码化染色质复合物固定到表面上；
e)使用TIRF显微镜在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物成像；
f)在单分子水平上对所述条形码化染色质复合物中的所述DNA进行顺序地测序以产生多个序列读取结果；和
g)将所述多个序列读取结果映射至参比基因组以产生所述测序读取结果的基因组位置以产生3D基因组联系图，
其中所述联系图指示所述染色质复合物中存在的所述基因组DNA和蛋白质在单分子水平上的物理相互作用。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述条形码化染色质复合物固定到表面上之前，所述条形码化染色质复合物通过能够结合所述条形码化染色质复合物中的所述特定蛋白质的第一抗体而免疫沉淀。


3.根据权利要求1所述的方法，其中对所述条形码化染色质复合物成像包括用能够结合所述条形码化染色质复合物中的所述特定蛋白质的第二抗体对所述条形码化染色质复合物进行免疫染色。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体相同。


5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中使所交联的基因组DNA片段化提供了多个染色质复合物，并且所述免疫沉淀使所述多个染色质复合物富集含有所述第一抗体结合的蛋白质的染色质复合物。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫沉淀使所述多个染色质复合物与所述免疫沉淀之前的所述多个染色质复合物相比富集所述含有所述第一抗体结合的蛋白质的染色质复合物至少2倍。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述条形码化接头包含荧光标记。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述条形码化接头还包含生物素分子，并且所述表面是链霉抗生物素蛋白涂覆的表面。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述交联是在细胞中进行，以使所述染色质复合物在所述细胞中保持完整，随后透化所述细胞。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述交联步骤是使用甲醛、EGS或两者进行。


11.根据权利要求10所述的方法，其中所述交联步骤是使用0.5至3.0％v/v甲醛和0.5mM至5mMEGS或两者进行。


12.根据权利要求10所述的方法，其中所述交联步骤是使用1.0％v/v甲醛和1.5mMEGS进行。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述透化步骤是使用洗涤剂进行。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述透化步骤是使用0.1％至3.0％w/vSDS进行。


15.根据权利要求13所述的方法，其中所述透化步骤是使用0.5％w/vSDS进行。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述片段化步骤是通过超声进行。


17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述片段化步骤是通过限制性酶消化进行。


18.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中所述条形码化染色质复合物被能够结合转录因子或染色质结构因子的抗体免疫沉淀。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体能够结合RNAPII、RARA、ER、CTCF或黏连蛋白。


20.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中所述第一抗体是ChIP抗体，其选自H3R2me2、AF9、AML1-ETO、BRD4、C/EBP、CBFb、CBX2、CBX8、CHD1、CHD7、CRISPR/Cas9、CTCF、CXXC1、DNMT3B、E2F6、ERR、ETO、EZH2、FOXA1、FOXA2、FOXM1、FUBP1、GR、GTF2E2、组蛋白H2A.X、H2A.Z、H2A.Zac、H2A.ZK4ac、H2A.ZK7ac、H2AK119ub、H2AK5ac、H2BK12ac、H2BK15ac、H2BK20ac、H2BK123ub、H2Bpan、H3.3、H3K14ac、H3K18ac、H3K18me1、H3K18me2、H3K23me2、H3K27ac、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K27me3S28p、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3K4ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K4me3T6p、H3k4un、H3K56ac、H3K56me1、H3K64me3、H3K79ac、H3K79me1、H3K79me3、H3K9/14ac、H3K9ac、H3K9acS10p、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3Kme3S10p、H3K9un、H3pan、H3R17me2、H3R17me2(asym)、H3R17me2(asym)K18ac、H3R2me2K4me2、H3T6pK9me3、H4K12ac、H4K16ac、H4K20ac、H4K20me1、H4K20me2、H4K20me3、H4K5,8,12ac、H4K5ac、H4K8ac、H4pan、H4S1p、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HIF1α、HP1、JARID1C、JMJ2a、JMJD6、KAP1、KAT2B、KDM6A、LSD1、MBD1、MBD1、MeCP2、MYH11、NCOR1、NF-E2、NFKB、NFYB、NRF1、NRF2、OCT4、p300、p53、PARP1、PAX8、Po1II、Po1IIS2p、PPARG、RbAp48、RBBP5、RFX-AP、RNF2、SAP30、SIN3A、Ski3、Ski8、SMAD1、SMAD2、SMYD3、Suz12、TAL1、TARDBP、TRP、TFIIF、THOC1、TIP5、TRRAP、Ty1、UHRF1、YY1、ZHX2和ZMYM3。


21.根据权利要求3至20中任一项所述的方法，其中所述条形码化染色质复合物被能够结合转录因子或染色质结构因子的抗体免疫染色。


22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗体能够结合RNAPII、RARA、ER、CTCF或黏连蛋白。


23.根据权利要求3至20中任一项所述的方法，其中所述第二抗体是ChIP抗体，其选自H3R2me2、AF9、AML1-ETO、BRD4、C/EBP、CBFb、CBX2、CBX8、CHD1、CHD7、CRISPR/Cas9、CTCF、CXXC1、DNMT3B、E2F6、ERR、ETO、EZH2、FOXA1、FOXA2、FOXM1、FUBP1、GR、GTF2E2、组蛋白H2A.X、H2A.Z、H2A.Zac、H2A.ZK4ac、H2A.ZK7ac、H2AK119ub、H2AK5ac、H2BK12ac、H2BK15ac、H2BK20ac、H2BK123ub、H2Bpan、H3.3、H3K14ac、H3K18ac、H3K18me1、H3K18me2、H3K23me2、H3K27ac、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K27me3S28p、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3K4ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K4me3T6p、H3k4un、H3K56ac、H3K56me1、H3K64me3、H3K79ac、H3K79me1、H3K79me3、H3K9/14ac、H3K9ac、H3K9acS10p、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3Kme3S10p、H3K9un、H3pan、H3R17me2、H3R17me2(asym)、H3R17me2(asym)K18ac、H3R2me2K4me2、H3T6pK9me3、H4K12ac、H4K16ac、H4K20ac、H4K20me1、H4K20me2、H4K20me3、H4K5,8,12ac、H4K5ac、H4K8ac、H4pan、H4S1p、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HIF1α、HP1、JARID1C、JMJ2a、JMJD6、KAP1、KAT2B、KDM6A、LSD1、MBD1、MBD1、MeCP2、MYH11、NCOR1、NF-E2、NFKB、NFYB、NRF1、NRF2、OCT4、p300、p53、PARP1、PAX8、Po1II、Po1IIS2p、PPARG、RbAp48、RBBP5、RFX-AP、RNF2、SAP30、SIN3A、Ski3、Ski8、SMAD1、SMAD2、SMYD3、Suz12、TAL1、TARDBP、TRP、TFIIF、THOC1、TIP5、TRRAP、Ty1、UHRF1、YY1、ZHX2和ZMYM3。


24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述染色质DNA在连接所述条形码化接头之前进行末端修复和加A尾。

【专利技术属性】
技术研发人员：阮一骏，郑梅珍，E·皮库克，
申请(专利权)人：杰克逊实验室，
类型：发明
国别省市：美国;US