【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纳米结构蛋白及其用途
本专利技术涉及纳米结构蛋白质材料领域，更具体地涉及可用于治疗的融合蛋白。
技术介绍
与游离分子相比，将药物以纳米缀合物形式全身施用受益于增强的药物稳定性。通过纳米级载体中的官能团化学并入，可以将有价值的另外的特性(比如细胞靶向性)合并到给定的混杂复合材料中，这得益于纳米材料的高表面/体积比。当全身施用时，在肺或其他高度血管化的器官中没有聚集的情况下，所得的大小在约8至100nm之间的载药缀合物可从肾脏过滤中逃逸。这一事实，与材料的合适的物理化学特性组合，可能会导致延长的循环时间和延长的药物暴露于靶器官，因此增强对患者的治疗影响和益处。在包括金属、陶瓷、聚合物和碳纳米管的作为药物载体的被研究的材料的多样性中，蛋白质提供了在生物相容性和可降解性方面的独特特性，在越来越多的纳米毒理学问题的背景下使它们尤其具有吸引力。然而，许多蛋白质种类本身就是可用于人类治疗的有效药物，这通过主要药物机构批准的多于400种基于蛋白质的产品证明。因此，蛋白质药物作为自组织结构单元——其在自组装为纳米颗粒后展现出固有的治疗活性——的工程化构成了有利的概念。因此，由于纳米材料本身起到纳米级药物(期望地在8和100nm之间)的作用，因此该方法无需进一步激活和药物偶联。以此方式，显示固有的治疗活性的化学均质的蛋白质纳米颗粒(如目前在人类医学中使用的普通蛋白质种类，例如激素、生长因子、疫苗等)可以在单个步骤中生物学地产生(作为纳米级组装实体)。由于该材料本身起到药物的作用，因此可以完全消除循环期间药物泄漏的可能性，...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包括：/n(i)聚阳离子肽，/n(ii)间插多肽区，和/n(iii)带正电荷的富含氨基酸的区域，/n其中所述间插多肽区不是荧光蛋白或人p53。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170505 EP 17169722.01.一种融合蛋白，其包括：
(i)聚阳离子肽，
(ii)间插多肽区，和
(iii)带正电荷的富含氨基酸的区域，
其中所述间插多肽区不是荧光蛋白或人p53。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽选自：
(i)富含精氨酸的序列，
(ii)能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列，
(iii)GW-H1肽，
(iv)CD44配体，
(v)能够穿越血脑屏障的肽，
(vi)穿透肽的细胞，和
(vii)核仁素结合肽。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽是包括选自RRRRRRRRR(SEQIDNO：1)、RRRGRGRRR(SEQIDNO：2)、RARGRGRRR(SEQIDNO：3)和RARGRGGGA(SEQIDNO：4)的序列的富含精氨酸的序列。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽包括能够与细胞表面上的受体特异性相互作用并促进所述融合蛋白在所述细胞上的内在化的序列，所述序列是CXCR4配体。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述CXCR4配体选自包括序列RRWCYRKCYKGYCYRKCR(SEQIDNO：5)、V1肽(SEQIDNO：6)、CXCL12肽(SEQIDNO：7)、vCCL2(SEQIDNO：8)或其功能等同变体的肽。
6.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽是CD44配体A5G27(SEQIDNO：15)或FNI/II/V(SEQIDNO：16)。
7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽是能够穿越血脑屏障的肽Seq-1-7(SEQIDNO：17)、Seq-1-8(SEQIDNO：18)、Angiopep-2-7(SEQIDNO:19)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述带正电荷的富含氨基酸的区域是聚组氨酸区域。
9.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述聚组氨酸区域包括3至6个组氨酸残基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的N端并且所述带正电荷的富含氨基酸的区域位于所述融合蛋白的C端，或者其中所述带正电荷的富含氨基酸的区域位于所述融合蛋白的N端并且所述聚阳离子肽位于所述融合蛋白的C端。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白，其中所述聚阳离子区域经由第一肽接头连接至治疗蛋白，和/或其中所述治疗蛋白经由第二肽接头连接至所述带正电荷的富含氨基酸的区域。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述第一肽接头包括GGSSRSS序列(SEQIDNO：32)或GGGNS序列(SEQIDNO：33)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述间插区是治疗剂。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述治疗剂选自：
(i)细胞毒素多肽，
(ii)抗血管生成多肽，
(iii)由肿瘤抑制基因编码的多肽，
(iv)促凋亡多肽，
(v)具有抗转移活性的多肽，
(vi)由能够激活针对肿瘤的免疫应答的多核苷酸编码的多肽，
(vii)化疗剂，
(viii)抗血管生成分子，
(ix)由自杀基因编码的多肽，和
(x)伴侣蛋白多肽。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述治疗剂是选自下列的细胞毒素多肽：BAK(SEQIDNO：35)、PUMA(SEQIDNO：36)、GW-H1(SEQIDNO：14)的BH3结构域，白喉毒素(SEQIDNO.37)、DITOX(SEQIDNO.43)的活性区段，铜绿假单胞菌的外毒素A(SEQIDNO.38)、PE24(SEQIDNO.44)和蓖麻毒素(SEQIDNO.45)的活性区段。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，进一步包括报告蛋白。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的组分通过肽连接，所述肽的序列包括针对蛋白酶的靶切割位点。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中包括针对蛋白酶的靶切割位点的所述肽位于所述聚阳离子肽和所述间插多肽区之间。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的融合蛋白，其中针对蛋白酶的靶切割位点选自弗林蛋白酶、肠激酶、因子Xa、凝血酶、TEV蛋白酶和PreScission蛋白酶。
20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中针对所述弗林蛋白酶的靶切割位点是SEQIDNO.46或SEQIDNO.47，针对肠激酶蛋白酶的靶切割位点是SEQIDNO.27，针对蛋白酶因子Xa的靶切割位点是SEQIDNO.28，针对凝血酶蛋白酶的靶切割位点是SEQIDNO.29，针对TEV蛋白酶的靶切割位点是SEQIDNO.30，针对PreScission蛋白酶的靶切割位点是SEQIDNO.31。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白，包括有助于内体逃逸的肽。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中有助于内体逃逸的肽是具有SEQIDNO.48的KDEL。
23.根据权利要求21或22中任一项所述的融合蛋白，其中所述有助于内体逃逸的肽位于所述融合蛋白的C端结构域。
24.一种制备包括多个拷贝的根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白的纳米颗粒的方法，包括将所述融合蛋白的制剂置于低盐缓冲液中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述低盐缓冲液选自碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述碳酸盐缓冲液包括浓度在100和300mM之间的碳酸氢钠，所述Tris缓冲液包括浓度在10和30mM之间的Tris，和/或其中所述磷酸盐缓冲液包括总浓度在5mM和20mM之间的Na2HPO4和NaH2PO4。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述低盐缓冲液进一步包括葡萄糖和/或甘油。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述缓冲液的pH在6.5和8.5之间。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述缓冲液选自：
(i)166mMNaHCO3，pH7.4，
(ii)20mMTris、500mM+5％葡萄糖pH7.4，和
(iii)140mMNaCl、7.5mMNa2HPO4、2.5mMNaH2PO4+10％甘油pH7.4。
30.一种编码根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。
31.一种载体，其包括如权利要求30中所限定的多核苷酸。
32.一种宿主细胞，其包括根据权利要求30所述的多核苷酸或根据权利要求31所述的载体。
33.一种纳米颗粒，其包括多个拷贝的根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白。
34.根据权利要求33所述的纳米颗粒，其具有在10和100nm之间的直径。
35.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白，根据权利要求30所述的多核苷酸，根据权利要求31所述的载体，根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33或34所述的纳米颗粒，用于医学。
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【专利技术属性】
技术研发人员：A·维拉维德科拉莱斯，E·威克斯格梅兹，N·塞尔纳罗梅罗，L·桑奇加尔西，U·尤祖艾塔艾洛尔扎，R·玛古艾斯巴法伊，M·V·塞斯佩德斯纳瓦罗，I·卡萨诺瓦里加特，
申请(专利权)人：巴塞罗那自治大学，圣十字圣保罗医院基金会，恩雷德生物医学调查中心，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES
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