抗体-树脂偶联设备和方法技术

一种抗体‑树脂偶联设备快速且高效地活化树脂珠粒并将所述树脂珠粒偶联到抗体，同时防止所述珠粒分解和交联，从而改进下游柱纯化过程、延长所述树脂珠粒的可用寿命并提高得到的树脂‑抗体复合物的分子捕获效率，以允许改进因子VIII分子或其它药物化合物的分离和纯化。

Equipment and method of antibody resin coupling

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体-树脂偶联设备和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年8月4日提交的美国申请第62/541,601号的权益和优先权，所述美国申请的内容通过引用的方式并入。
本公开涉及用于活化树脂并将抗体偶联到树脂的装置和方法。
技术介绍
血友病是防止血液正常凝固并且以出血为特征的遗传性出血病状，所述出血可能自发地或在轻微创伤后发生。血友病通常与必需的血液凝固蛋白因子VIII(还称为抗血友病因子(AHF))的缺乏相关联。在人类中，因子VIII由F8基因编码。该基因的缺陷导致了血友病A(“经典”血友病)，一种导致血浆凝固时间延长的隐性的X连锁凝血病状。另一种类型的血友病是发生在F8基因正常但出现抑制因子VIII的自身抗体从而产生了阻碍凝血的功能缺陷的患者身上的获得性血友病A(AHA)。向血友病患者提供静脉因子VIII可以暂时改善凝固。针对血友病的许多治疗，如可从夏尔制药公司(ShirePlc)(马萨诸塞州列克星敦市(Lexington,MA))获得的以商标RECOMBINATE、ADVATE、ADYNOVATE、HEMOFIL和OBIZUR销售的血友病治疗涉及在实验室中合成和纯化的重组因子VIII蛋白。然而，产生此类治疗的主要限制因素是分离和纯化因子VIII分子的能力。一种方法是使用因子VIII的抗体来捕获柱中的分子。将抗体与树脂偶联并装载到柱中，并且使含有表达的因子VIII分子的培养基从柱中穿过。该纯化过程需要高精度来正确地操纵树脂。由于树脂昂贵并且如果不正确地加工则容易损坏或浪费，因此该纯化过程执行起来成本极高。当树脂未与抗体充分偶联时，树脂珠粒之间可能发生交联。如果不仔细地处理树脂，则珠粒还可能分解。分解的或交联的树脂珠粒会堵塞柱，从而产生过大的背压并且导致提取过程失败。因此，树脂处理程序的困难和树脂-抗体偶联技术的局限性使血友病药物的制造过程昂贵且复杂。
技术实现思路
本文所述的设备高效地活化了树脂珠粒并将其偶联到抗体，同时防止了珠粒的分解和交联，从而改进下游柱纯化过程、延长树脂珠粒的可用寿命并提高得到的树脂-抗体复合物的分子捕获效率，以允许改进包含因子VIII分子在内的各种生物化合物的分离和纯化。尽管本文参考设备在FVIII纯化中的用途对所述设备进行了总体描述，但是应当理解，所述设备和相关方法可用于将所有类型的抗体偶联到多孔树脂。本公开的专利技术可以应用于其它亲和树脂，特别是用于其它酶替代治疗产物或任何其它感兴趣的药物或生物分子。其适用于含蛋白质或胺的配体与树脂支撑体之间的交联化学作用。树脂可以是琼脂糖、玻璃或其它已知的各种密度的多孔树脂。所用抗体可以是多克隆的或单克隆的。虽然所述装置在本文中主要被描述为可用于将抗体偶联到树脂，但是本专利技术可以兼容羟基偶联到氨基的任何化学物质。应当理解，本专利技术可与可以用于任何生物化合物的亲和色谱纯化的任何已知抗体，包含肽、核酸、碳水化合物和任何具有氨基的配体。所述设备总体上是一种混合装置，所述混合装置包含具有用于引入树脂珠粒和各种流体的入口的容器、用于精确施加活化溶液的分散管、用于支撑树脂珠粒并允许流体流过的网筛、用于在流体流过时混合珠粒的搅拌器以及用于排出流体的在网筛下方的出口。设备的部件可以由不锈钢或其它弹性材料制成。在操作时，缓冲溶液中的树脂珠粒在经由分散管通过分散CNBr和乙腈被活化之前被倒入容器中。在流体通过出口排出之前，使用搅拌器将珠粒搅拌一小段时间(大约3分钟或更短的时间)。在加入偶联溶液和单克隆抗体之前，可以用水或其它缓冲液洗涤珠粒。珠粒和抗体在搅拌下培育一段设定的时间，同时装置维持低温并监测溶液的pH。将抗体偶联的树脂捕获在网筛上并从装置中取出以供使用。装置可以用于各种树脂和抗体类型。系统允许快速且均匀地活化大量树脂，而不使树脂珠粒破碎并避免珠粒之间的交联。这提供了更有效的树脂-抗体偶联，同时控制化学作用以延长树脂珠粒的可用寿命。装置的一个关键方面是分散管，针对CNBr活化溶液到树脂的分散对所述分散管进行了优化。这允许CNBr在受控的时间周期内均匀分布并且有助于快速(优选地，在约3分钟内)实现加入活化溶液。这些因素对于抗体与树脂的均质偶联很重要，因为所述因素减少了向树脂/缓冲液混合物中加入溶液的变化，所述变化可以暂时超过缓冲液的缓冲能力。这种可变性将会导致不期望的异脲交联，所述异脲交联将会发生水解并增加抗体浸出或潜在地与其它亲核试剂交换从而污染树脂或导致浸出增加。控制对活化溶液的定时有助于对抗体偶联的下游过程控制，因为这样允许最佳的树脂活化，然后在树脂上的大量活化的基团丢失之前快速加入抗体。在某些方面，本公开涉及一种用于将抗体偶联到树脂的装置。所述装置包含混合容器，所述混合容器通过跨所述容器伸展的网筛分成上部和下部，所述上部具有至少一个入口并且所述下部具有至少一个出口，并且所述网筛的孔径介于5与80μm之间。所述装置进一步包含安置在所述上部内的搅拌器和在所述搅拌器上方的分散设备。所述分散设备包含形成管腔的细长管状结构。所述管状结构具有：近侧部分，所述近侧部分竖直延伸到所述混合容器的外部、具有向上开口的入口；远侧部分，所述远端部分具有封闭端和水平定位于所述上部内的多个面向下的孔；以及弯头，所述弯头连接所述远侧部分与所述近侧部分。所述搅拌器可以包含转子和旋转叶轮，所述旋转叶轮包含轮毂和从所述轮毂沿相反方向垂直延伸的至少两个叶片。每个叶片具有大致横向于所述转子的轴线的轴线，所述轮毂被配置成在所述转子的所述轴线上旋转。搅拌器被配置成旋转以向容器中的流体施加力，从而提供提升力并保持珠粒在网筛上移动。所述网筛还可以具有被配置成支撑所述网筛并防止所述网筛弯曲的支撑梁。所述网筛可以被配置成可从所述容器移除。所述搅拌器以足以快速混合树脂珠粒而不使其破碎的速度旋转。搅拌器转速可以在约10与50RPM之间，并且在特定实施例中，速度为20或35RPM。在实施例中，所述叶片具有固定节距和圆形边缘。在相关方面，本公开涉及一种分散管设备，所述分散管设备包含形成具有圆形截面的管腔的细长管状结构。所述管状结构包含具有面向上的入口的近侧部分、具有封闭端的远侧部分以及平行于所述远侧部分的轴线布置成两行或两行以上的介于4与100个—并且优选地，约8至30个—之间的面向下的孔。所述行彼此以介于约15度与约60度之间的间隔定位在所述远侧部分上。所述管状结构还包含介于所述远侧部分与所述近侧部分之间的弯头，所述弯头包括所述管状结构的弯部，所述弯部用于使所述入口定向成使得所述入口在基本上垂直于所述远侧部分的所述轴线的方向上开口。在一些实施例中，所述分散设备的所述远侧部分具有三行平行的面向下的孔。在一些实施例中，具有介于12与25个之间的面向下的孔，并且在优选的实施例中，有21个孔，其中10个、8个和3个孔成行布置。在一些实施例中，所述行具有不同数量的孔，而在其它实施例中，所述行具有相同数量的孔。所述行的孔可以介于约15度与105度之间的间隔定位。弯头部分中的弯部使远侧部分与近侧部分相对于彼此定向成介于60度与120度之间并且在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分散设备，包括：/n细长管状结构，所述细长管状结构形成具有圆形截面的管腔，所述管状结构包括：/n(a)具有面向上的入口的近侧部分；(b)具有封闭端的远侧部分，所述远侧部分包括平行于所述远侧部分的轴线布置成三行的多个面向下的孔，并且其中所述三行彼此以介于约15度与约60度之间的间隔定位在所述远侧部分上；以及(c)介于所述远侧部分与所述近侧部分之间的弯头，所述弯头包括所述管状结构的弯部，所述弯部使所述入口定向成使得所述入口在基本上垂直于所述远侧部分的所述轴线的方向上开口。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170804 US 62/541,6011.一种分散设备，包括：
细长管状结构，所述细长管状结构形成具有圆形截面的管腔，所述管状结构包括：
(a)具有面向上的入口的近侧部分；(b)具有封闭端的远侧部分，所述远侧部分包括平行于所述远侧部分的轴线布置成三行的多个面向下的孔，并且其中所述三行彼此以介于约15度与约60度之间的间隔定位在所述远侧部分上；以及(c)介于所述远侧部分与所述近侧部分之间的弯头，所述弯头包括所述管状结构的弯部，所述弯部使所述入口定向成使得所述入口在基本上垂直于所述远侧部分的所述轴线的方向上开口。


2.根据权利要求1所述的分散设备，其中所述远侧部分包括介于8与30个之间的面向下的孔。


3.根据权利要求2所述的分散设备，其中所述远侧部分包括正好21个面向下的孔。


4.根据权利要求3所述的分散设备，其中所述三行中的第一行有10个孔，所述三行中的第二行有8个孔，并且所述三行中的第三行有3个孔。


5.根据权利要求1所述的分散设备，其中所述三行具有不同数量的孔。


6.根据权利要求1所述的分散设备，其中所述三行具有相同数量的孔。


7.根据权利要求1所述的分散设备，其中所述三行各自以介于30与60度之间的间隔定位。


8.根据权利要求7所述的分散设备，其中所述三行各自以45度的间隔定位。


9.根据权利要求1所述的分散设备，其中所述弯头的所述弯部使所述远侧部分和所述近侧部分相对于彼此定向成介于60与120度之间。


10.根据权利要求9所述的分散设备，其中所述弯头的所述弯部使所述远侧部分和所述近侧部分相对于彼此定向成介于80与100度之间。


11.根据权利要求10所述的分散设备，其中所述弯头的所述弯部使所述远侧部分和所述近侧部分相对于彼此定向成正好90度。


12.根据权利要求1所述的分散设备，其中所述管状结构包括不锈钢。


13.根据权利要求1所述的分散设备，进一步包括用于打开和关闭所述入口的阀。


14.根据权利要求1所述的分散设备，进一步包括能够连接到所述入口的漏斗。


15.一种树脂洗涤设备，包括：
容器，所述容器包括圆筒，所述圆筒通过跨所述圆筒伸展的网筛分成上部和下部，所述上部包括入口并且所述下部包括出口；以及
搅拌器，所述搅拌器安置在所述上部内，所述搅拌器包括转子和旋转叶轮，所述旋转叶轮包括轮毂、第一叶片和第二叶片，所述第一叶片和所述第二叶片从所述轮毂沿相反方向垂直延伸，每个叶片具有横向于所述转子的轴线的轴线，所述轮毂被配置成在所述转子的所述轴线上旋转；
其中所述网筛包括孔径介于约5μm与约80μm之间的网状材料；并且
其中所述搅拌器被配置成向所述容器中的流体施加力，其中所述力被引导远离所述网筛。


16.根据权利要求15所述的树脂洗涤设备，其中每个叶片具有固定节距。


17.根据权利要求15所述的树脂洗涤设备，其中所述叶片具有圆形边缘。


18.根据权利要求15所述的树脂洗涤设备，其中所述搅拌器以足以快速混合树脂珠粒而不使所述树脂珠粒破碎的速度旋转。


19.根据权利要求15所述的树脂洗涤设备，其中所述搅拌器以介于10与50RPM之间的速度旋转。


20.根据权利要求19所述的树脂洗涤设备，其中所述搅拌器以20RPM的速度旋转。


21.根据权利要求19所述的树脂洗涤设备，其中所述搅拌器以35RPM的速度旋转。


22.根据权利要求19所述的树脂洗涤设备，其中所述网筛孔径为30μm。


23.根据权利要求15所述的树脂洗涤设备，进一步包括支撑梁，所述支撑梁被配置成支撑所述筛并防止所述筛弯曲。


24.根据权利要求15所述的树脂洗涤设备，其中所述网筛能够从所述容器移除。


25.一种用于将抗体偶联到树脂的装置，所述装置包括：
混合容器，所述混合容器通过跨所述容器伸展的网筛分成上部和下部，所述上部包括入口并且所述下部包括出口，并且其中所述网筛的孔径介于约5μm与约80μm之间；
搅拌器，所述搅拌器安置在所述上部内；以及

【专利技术属性】
技术研发人员：R·托索，R·施庞戈德，M·丹，V·泰利奥尔，Y·林，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US