一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法及检测试剂盒，在移植后GVHD的早期评估和诊断方面具有重要的临床意义。通过本发明专利技术所述的检测方法与试剂盒，能够同时快速均相检测GVHD诊断与预后相关细胞因子IL‑6、IL‑8、ST2、Reg3α、Elafin、TNFR1、可溶性IL‑2R、HGF中的一项或多项不同组合的指标，实现单样本多重检测，节省时间和资源，软件自动分析结果，更加客观准确，而且本发明专利技术所述方法简便，检测安全，样本用量少。本发明专利技术的应用能够及时快速、长期稳定的评估移植后患者GVHD的风险，提高了患者治疗的准确性和时效性，挽救患者的生命。

A method and kit for detecting GVHD related cytokines after transplantation by flow cytometry

【技术实现步骤摘要】
一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法及检测试剂盒
本专利技术属于免疫诊断检测领域，具体涉及一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法及检测试剂盒。
技术介绍
随着医疗技术的发展，移植医学已经广泛应用于各种重大疾病的治疗中。例如：器官移植、骨髓移植以及细胞移植等等。然而在移植治疗中，术后发病率高达50%-80%的术后并发症GVHD（移植物抗宿主反应）一直是困扰医生的难题。GVHD是指由于移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相融性抗原受者的组织之间的反应，是移植后患者死亡的主要原因。因此，移植后评估、监测以及抑制GVHD成为治疗的关键。流式细胞术是近些年发展期起来的新技术，能够对一个样本进行多参数高通量检测，检测速度快、精度高、准确性好。CBA（CytometricBeadArray）即细胞因子微球检测技术，是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。CBA集ELISA和细胞流式技术优点为一身，利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——捕获微球-细胞因子-检测抗体夹心复合物所散发的荧光，从而测定待测物的数量，这种方法对样本需求量更少，检测更快速、更准确。目前GVHD诊断的主要依据是皮肤、肝脏和胃肠道三大靶器官的临床表现。用于GVHD诊断的方法为活组织检查，诊断过程非常复杂。鉴于目前针对GVHD诊断的手段复杂，特异性不高，研发一种快速且特异性高的评估GVHD的试剂盒具有很大的必要性。研究显示，细胞因子在GVHD发病过程中具有重要意义。因此，可以通过移植后外周血中细胞因子的监测来对病人GVHD发病的风险性进行评估和诊断。
技术实现思路
通过本专利技术所述的检测方法与试剂盒，能够同时快速均相检测GVHD诊断与预后相关细胞因子IL-6、IL-8、ST2、Reg3α、Elafin、TNFR1、可溶性IL-2R、HGF八项中的一项或多项不同组合的指标。针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法，采用如下技术方案：应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法，具体包括以下步骤：一、捕捉微球的制备将标记有APC荧光素的聚苯乙烯微球与捕获抗体偶联，不同的捕获抗体与不同荧光强度的微球相结合，通过荧光强度识别不同的细胞因子（见图2）。本专利技术方法可同时检测8种细胞因子，使用一种微球区别同种荧光素8种不同荧光强度的效果较差，不易区分，为更好地进行结果分析，本专利技术选用不同大小与颗粒度的2群聚苯乙烯微球为微球1和微球2，大小相同的每种微球有4种不同荧光强度；制备IL-6、IL-8、TNFR1、ST2捕捉微球使用的是微球1，制备Reg3α、Elafin、可溶性IL-2R、HGF捕捉微球使用的是微球2（见图3）。二、检测抗体的制备用荧光素标记检测抗体，所述检测抗体与捕获抗体为配对抗体。三、标准品的制备标准品为人IL-6重组蛋白冻干粉、人IL-8重组蛋白冻干粉、人ST2重组蛋白冻干粉、人Reg3α重组蛋白冻干粉、人Elafin重组蛋白冻干粉、人TNFR1重组蛋白冻干粉、人可溶性IL-2R重组蛋白冻干粉、人HGF重组蛋白冻干粉。四、检测反应体系：捕捉微球25ul+样本或标准品溶液25ul+检测抗体25ul上述反应体系中，检测抗体上标记PE荧光素，将微球和检测抗体以及样本混合后，就形成了捕获微球-细胞因子-检测抗体这样双抗夹心复合物，通过流式测定PE荧光强度，结合标准曲线，分析软件即可计算出每种细胞因子的浓度。五、标准曲线制作将等比稀释的0-5000pg/ml不同浓度的细胞因子标准品蛋白与捕捉微球和检测抗体等体积混合后，室温避光孵育反应，加入清洗液清洗后，将该复合物置于流式细胞仪检测PE通道荧光强度，通过FSC和SSC确定微球群后，通过微球本身APC荧光素的不同强度判定微球，决定被检测细胞因子，通过软件对不同细胞因子浓度分别绘制标准曲线，曲线坐标为细胞因子蛋白浓度和检测平均荧光强度MFI。六、待测样本检测通过流式细胞仪检测待测样本复合物PE通道的荧光强度MFI，将荧光强度值带入标准曲线，即可得到待测样本中细胞因子的浓度。本专利技术的另一目的在于提供一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的检测试剂盒，技术方案如下：一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的检测试剂盒，包括微球缓冲液、样本缓冲液、清洗液、校准微球、标准品A、标准品B和至少一种捕捉微球、至少一种检测抗体、至少一种标准品蛋白。其中校准微球用于调整FSC和SSC，得到微球群、标准品A为FITC阳性对照、标准品B为PE阳性对照，二者用于调节通道补偿。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术提供了一种应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的方法及检测试剂盒，在移植后GVHD的早期评估和诊断方面具有重要的临床意义。通过本专利技术所述的检测方法与试剂盒，能够同时快速均相检测GVHD诊断与预后相关细胞因子IL-6、IL-8、ST2、Reg3α、Elafin、TNFR1、可溶性IL-2R、HGF中的一项或多项不同组合的指标，实现单样本多重检测，节省时间和资源，软件自动分析结果，更加客观准确，而且本专利技术所述方法简便，检测安全，样本用量少，仅需25ul即可检测多重指标，且不会造成环境污染和对患者的伤害。相对于目前传统的活组织检查的诊断手段，本专利技术具有早期评估临床相关性高，特异性高，动态评估灵敏度好，操作简单等方面的优势。为临床能够准确快速的评估监测GVHD提供了新的方法和材料。本专利技术的应用能够及时快速、长期稳定的评估移植后患者GVHD的风险，提高了患者治疗的准确性和时效性，挽救患者的生命。附图说明图1为本专利技术技术原理示意图；图2为本专利技术不同荧光强度的捕捉微球流式细胞仪分析图；图3为本专利技术不同大小（FSC）和颗粒度（SSC）的2群捕捉微球流式细胞分析图；图4为本专利技术方法检测8因子流式细胞仪分析结果图；图5-图12依次为本专利技术IL-6、IL-8、ST2、Reg3α、Elafin、TNFR1、可溶性IL-2R、HGF标准曲线图，其横坐标为IL-6细胞因子浓度（单位pg/mL），纵坐标为平均荧光强度值（MFI），图中各个点所标识的数字，为该检测浓度所对应的MFI。具体实施方式一、缓冲溶液的制备1.微球缓冲液的制备本实施例涉及的微球缓冲液是含有体积分数5%的FBS的PBS溶液，其配制方法是：量取50mLFBS，加入950mLpH7.20.1M的PBS缓冲液中，加入0.09%NaN3,混合均匀，0.45μm水系过滤膜过滤。2.样本缓冲液的制备本实施例涉及的样本缓冲液是含有0.2%BSA（w/v）的PBS溶液，其配制方法是：称取2mgBSA，溶解于1L体积pH7.20.1M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.应用流式细胞术检测移植后GVHD相关蛋白的方法，其特征在于，包括：捕捉微球的制备、检测抗体的制备、缓冲液的制备、标准曲线的制备、待测样品的检测；/n所述细胞因子为IL-6、IL-8、ST2、Reg3α、Elafin、TNFR1、可溶性IL-2R、HGF的一种或几种。/n

【技术特征摘要】
1.应用流式细胞术检测移植后GVHD相关蛋白的方法，其特征在于，包括：捕捉微球的制备、检测抗体的制备、缓冲液的制备、标准曲线的制备、待测样品的检测；
所述细胞因子为IL-6、IL-8、ST2、Reg3α、Elafin、TNFR1、可溶性IL-2R、HGF的一种或几种。


2.应用流式细胞术检测移植后GVHD相关细胞因子的检测试剂盒，其特征在于：包含微球缓冲液、样品缓冲液、清洗液、校准微球、标准品A、标准品B和至少一种捕捉微球、至少一种检测抗体、至少一种标准品蛋白；
所述捕捉微球为IL-6捕捉微球、IL-8捕捉微球、ST2捕捉微球、Reg3α捕捉微球、Elafin捕捉微球、TNFR1捕捉微球、可溶性IL-2R捕捉微球、HGF捕捉微球的一种或几种；
所述检测抗体为PE-IL-6检测抗体、PE-IL-8检测抗体、PE-ST2检测抗体、PE-Reg3α检...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪建，
申请(专利权)人：天津美瑞特医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12