一种用于检测PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子检测技术领域，通过设计并筛选得到一种用于猪流行性腹泻病毒检测的LAMP引物组合。另外，本发明专利技术提供了一种结合微流控芯片技术与LAMP检测方法的试剂盒，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的猪流行性腹泻病毒核酸检测方法；本发明专利技术提供的微流控芯片检测方法特异性高，不与猪其他腹泻病原交叉反应，且最低检测限可达到10

A primer and kit for the detection of PEDV by centrifugal microfluidic chip combined with loop mediated isothermal amplification

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物和试剂盒
本专利技术涉及分子检测
，更具体的，涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物和试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻(Procineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的腹泻，呕吐，脱水，食欲下降为特征的一种高度接触性肠道传染病。该病主要经“粪-口”途径传播，具有明显的季节性，冬春季节集中爆发，夏季零散发生，对各个生长阶段的猪均易感，对哺乳期内仔猪威胁最为严重，发病率和致死率可达100％。自上世纪80年代以来，PED在我国频发，直至2010年，PED如井喷式爆发，我国32个省市均爆发疫情。结合大量的临床病料检测结果来看，PEDV已成为导致我国猪群腹泻的最主要病原，其阳性率远远超过TGEV、RV等其他腹泻病原，每年给我国养猪业造成巨大的经济损失。PEDV属于冠状病毒科，Alpha冠状病毒属。PEDV基因组为线性单股正链RNA，全长为28kb左右，包括5’非翻译区，至少7个开放阅读框(ORF1a，ORF1b，ORF2-6)和3’非翻译区。7个ORFs的大小以及5’到3’的顺序分别为：占据PEDV基因全长2/3的ORF1a和ORF1b，其余为S、ORF3、E、M和N。由于多种腹泻病毒造成的临床症状和病理变化相似，临床上难以诊断，对PEDV的诊断需要借助实验室分子生物学方法。目前，应用于PEDV的诊断方法主要为：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光定量PCR，免疫荧光法，免疫电镜法，间接血凝试验等。以上检测手段，特异性和灵敏性均具有优势，但是这些检测方法的实施需要专业的人员操作，高价的检测设备且检测周期长，因此技术要求相对较高，无法推广使用。而即时检测(Pointofcaretesting，POCT)可以借助小型的桌面式设备或试剂对疾病进行现场快速诊断，具有快速、便捷，检测成本低等优点，近年来各种POCT检测产品逐步在市场推广并被接受。微流控POCT检测技术是近十年发展起来的一种快检技术，微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)，是微流控技术实现的主要平台。微流控芯片将常规实验室的样品制备，试剂加样，样本分离，反应进行和结果检测在内的全过程集合在一张几平方厘米的芯片中，通过芯片内多个独立的反应腔室实现多靶标检测分析。便携化、自动化、集成化、低成本、高通量、操作简单等优势为微流控芯片技术在医学检测、疾病诊断、食品安全、环境监测等多领域内提供了广阔的应用前景。环介导等温扩增技术是一种新型的核酸扩增法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6种特异引物，利用具有活性的链置换DNA聚合酶，在恒温条件(60℃-65℃)下进行DNA模板的链置换扩增反应。其优点在于反应在等温条件下进行，无需复杂的变温程序；扩增效率高，1h内可达到1010倍扩增。灵敏度高，比传统PCR高2～5个数量级。目前许多研究将环介导等温扩增与微流控芯片结合，从而对病原体、耐药基因位点、肿瘤标记基因等快速检测。现有技术缺乏针对PEDV的POCT检测技术。
技术实现思路
针对上述现有技术缺乏对PEDV的POCT检测技术，本专利技术首先提供一种微流控芯片技术结合LAMP核酸扩增方法用于猪流行性腹泻病毒检测的引物组合。本专利技术的第二个目的是提供含有上述引物组合的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物组，所述引物组包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB，所述外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB的序列如SEQIDNO：1～5所示。优选的，其中，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB的摩尔比为1：8：4。本专利技术还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组，所述引物组的每条引物的浓度为50μM。优选的，所述试剂盒还包括微流控芯片、阳性标准品。更优选的，所述微流控芯片设有8个互不相通的反应检测部分，每一反应检测部分具有1个加样孔和1组反应池，每组反应池包括2个临床样本扩增池和2个阴性对照反应池。更优选的，所述阳性标准品为TPEDV-M-RNA。所述阳性标准品的制备：从PEDV阳性病料抽提RNA，经逆转录成cDNA，再经PCR将PEDV-M基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收后，经与pGEM-Teasy载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，将pGEM-T-PEDV质粒线性化后纯化，用体外转录试剂盒RibomaxTMLargeScaleRNAProductionSystems(Promega)的说明书进行目的基因的转录，获得体外转录标准品TPEDV-M-RNA。优选的，所述试剂盒还包括恒温扩增预混液、逆转录酶溶液和RNase抑制剂。更优选的，所述恒温扩增预混液为含有800U/mLBstDNA聚合酶和50μM荧光染料SYBRGreen的LAMP反应液，所述逆转录酶溶液为5000U/mL的M-MLV，RNase抑制剂浓度为40U/μL。优选的，所述引物组提前包被在临床样本扩增池上。更有选的，上述引物包被在临床样本扩增池的过程为：将上述引物组内每一种引物分别与蔗糖混合，配制成相应的混合溶液，蔗糖和每一条引物在所述混合液中的终浓度分别为1.0％(质量百分比)和0.15μM；取1.5μL混合液点入微流控芯片相应的扩增池内，于60℃干燥台上干燥，压片封膜，冲压抽真空后，引物组被包被于相应的扩增池中。本专利技术还提供上述试剂盒的使用方法：(1)待测样品核酸抽提；(2)LAMP反应：将试剂盒中的恒温扩增预混液、逆转录酶，RNase抑制剂与待检样品核酸混合后，转移至包被引物组的微流控芯片的进样池，在离心力的作用下流入扩增池内，随后进行LAMP反应；(3)结果判读：采用微流控设备读取荧光值进行结果的判读，微流控芯片检测装置采集的每个扩增池对应的荧光强度值在显示屏上呈现“S”型，且阴性对照Ct值为“0”时，判断样品含有猪流行性腹泻病毒核酸，否则待检样品中不含猪流行性腹泻病毒核酸。优选的，步骤(2)的LAMP反应的具体操作为：首先取10μL恒温扩增预混液，加0.1μL逆转录酶和0.1μLRNase抑制剂，与14.8μL待检样品的核酸混合后，转移至包被引物组的微流控芯片的进样池，在所述离心机中，1600rpm/min瞬时离心10s以混匀反应液；再4600rpm/min离心30s使液体在离心力作用下流入扩增池内，在37℃下恒温反应20min。反应结束后，按照仪器程序显示顺序，温度设定为63.5℃，低速离心转速为160本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB，所述外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB的序列如SEQ ID NO：1～5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB，所述外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB的序列如SEQIDNO：1～5所示。


2.根据权利要求1所述的用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的引物组，其特征在于，其中，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP，和环引物LB的摩尔比为1：8：4。


3.一种用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组，所述引物组的每条引物的浓度为50μM。


4.根据权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微流控芯片、阳性标准品。


5.根据权利要求4所述的用于检测猪流行性腹泻病毒PEDV的离心式...

【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，周玲，陈咏辉，卢先东，方雪恩，刘艳红，孔继烈，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44