一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学检测技术领域，公开了一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组及试剂盒，通过在检测的过程中同时设计一个内标检测，即通过检测引物和内标引物的共同使用，能够及时发现检测中的假阴性结果，可有效防止因假阴性检测结果引起各种事故，该内标检测及检测方法具有以下特点：1)内标基因与实际样品的检测在同一管中进行检测，2)该内标基因的扩增靶标与样品检测的扩增靶标部分相同，3)内标基因的扩增靶标的核酸浓度在该内标基因的检测线附近，可识别轻微的反应抑制。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性。

A primer set and kit for eliminating false negative Zika virus

【技术实现步骤摘要】
一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测
，更具体的，涉及一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组及试剂盒。
技术介绍
寨卡病毒(zikavirus，ZIKV)是经埃及伊蚊传播引起的一种自限性急性传染病，主要症状类似流感，表现为轻度发热、头痛、肌肉痛、关节痛、结膜炎以及皮肤斑疹等。研究表明寨卡病毒可造成小头症和格林-巴利综合征。目前，寨卡病毒病既无特异性的治疗药物，也无安全可靠的疫苗。寨卡病毒颗粒为圆球形，直径约40-70nm，具有包膜，表面有棘突。基因组全长10794bp，基因组的5′端及3′端各有一段非编码区(non-codingregion，NCR)、仅有一个开放的阅读框(ORF)。ORF共编码一个全长3419个氨基酸的多聚蛋白，经过编译的多聚蛋白被蛋白酶水解后，进一步裂解成三个病毒结构蛋白：衣壳蛋白(capsidvirus，C)、前膜蛋白(premembranceprotein，PrM)或膜蛋白(membranceprotein，M)、包膜蛋白(envelopeprotein，E)；和7个病毒非结构蛋白(non-structuralprotein、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。衣壳蛋白(capsidvirus,C)与基因组RNA结合构成寨卡病毒体的核心；E蛋白是寨卡病毒颗粒主要的表面抗原蛋白；NS5蛋白是最大的病毒蛋白。病毒的复制是在细胞质内完成的(亦有寨卡病毒的抗原出现于被感染的细胞核中)，其3个结构蛋白(C、prM/M、E)在宿主细胞因子的作用下可以包装成为成熟的病毒颗粒，而7个非结构蛋白主要参与寨卡病毒的复制以及后期病毒颗粒的组装。根据其非结构蛋白NS5基因序列寨卡病毒可分为亚洲谱系、东非谱系及西非谱系。它们之间NS5基因核酸序列的同源性已达89％，其氨基酸序列的相似性高达97％。2015年在美洲广泛流行的寨卡病毒株则与亚洲谱系十分相近。寨卡病毒感染的检测，包括血清学试验、核酸检测和病毒分离鉴定。血清学检测主要包括用ELISA或IFA检测IgM抗体和IgG抗体，以及中和试验检测中和抗体。由于不同黄病毒的感染和疫苗免疫接种，机体产生的抗体往往会出现广泛的交叉反应，使得黄病毒之间的血清学反应非常复杂，寨卡病毒和登革病毒具有高度的交叉免疫反应性。病毒分离鉴定仍然是“金标准”，但复杂耗时、费力，一般在具有生物安全级别的科研实验室开展，不作为临床实验室检验方法。以核酸为基础的PCR技术及恒温扩增技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于寨卡病毒检测。但检测样品复杂，因目前检测方法对假阴性的检测结果没有采取监控手段，故存在漏检的可能，但寨卡病毒危害严重，漏检造成的危害无法估量。此外，PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种可鉴别假阴性检测结果的快速、高通量且对仪器要求不高的寨卡病毒检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术首先提供一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组。本专利技术的第二个目的是一种寨卡病毒反转录环介导恒温荧光检测试剂盒。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组，所述检测引物组包含外引物对NS5-F/NS5-B、内引物对NS5-FIP/NS5-BIP、环引物对NS5-LF/NS5-LB和内标引物NS5-P，所述外引物对、内引物对和环引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1～6所示，所述内标引物NS5-P为含有荧光基因和淬灭基因的荧光探针，所述内标引物NS5-P的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。所述外引物对NS5-F/NS5-B、内引物对NS5-FIP/NS5-BIP、环引物对NS5-LF/NS5-LB的核苷酸序列如下：NS5-F:5’-GGTGCAACTCATTCGGAA-3’(SEQIDNO：1)；NS5-B:5’-ACTCTTGTGTGTCCTTCCTA-3’(SEQIDNO：2)；NS5-FIP:5’-TCTCTGACCTCCGCAGCAATGGAGGCTGAGGAAGTT-3’(SEQIDNO：3)；NS5-BIP:5’-TGACCAACTGGTTGCAGAGCGCTTCACAACGCAATCATC-3’(SEQIDNO：4)；NS5-LF:5’-GCCACAAGTCTTGCATCTCTA-3’(SEQIDNO：5)；NS5-LB:5’-ACGAATGGCAGTCAGTGG-3’(SEQIDNO：6)。所述内标引物NS5-P的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。NS5-P：FAM-CGCAATCATCTCCACTGACTGCC-TAMRA(SEQIDNO：7)。本专利技术通过在检测的过程中同时设计一个内标检测，即通过检测引物和内标引物的共同使用，检测过程中，样品检测的扩增靶标和内标检测的扩增靶标部分相同，内标基因的扩增靶标的核酸浓度在该内标基因的检测线附近，可识别轻微的反应抑制。正常情况下检测反应在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标靶标片段，所以内标检测的检测结果为阳性，如内标检测的结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测不能进行扩增反应，同样样品检测也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。本专利技术还提供一种寨卡病毒反转录环介导恒温荧光检测试剂盒，该检测试剂盒含有上述用于消除假阴性的寨卡病毒恒温荧光检测引物组，从而实现实际检测过程中消除假阴性的问题。优选的，该检测试剂盒中，所述外引物对NS5-F/NS5-B、内引物对NS5-FIP/NS5-BIP、环引物对NS5-LF/NS5-LB的摩尔比为1～2：4～8：2～4。优选的，所述检测试剂盒还包括DNA聚合酶、RNA反转录酶、内标、反应液、阳性对照和阴性对照。具体的，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述RNA反转录酶为AMV反转录酶。优选的，所述反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和100mMMgSO4水溶液；三者的体积比是7：5：3。优选的，所述阳性对照为含有寨卡病毒NS5基因cDNA片段的T载体克隆，所述阴性对照为超纯水。优选的，所述内标为含有部分寨卡病毒cDNA片段的T载体克隆。优选的，所述检测试剂盒的反应体系包括：NS5-F0.2μM，NS5-B0.2μM，NS5-FIP1.5μM，NS5-BIP1.5μM，NS5-LF0.8μM，NS5-LB0.8μM，NS5-P0.2μM，反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，AMV反转录酶0.2U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，内标基因2μl，用超纯水补齐到25μl。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组，其特征在于，所述检测引物组包含外引物对NS5-F/NS5-B、内引物对NS5-FIP/NS5-BIP、环引物对NS5-LF/NS5-LB和内标引物NS5-P，所述外引物对、内引物对和环引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示，所述内标引物NS5-P为含有荧光基因和淬灭基因的荧光探针，所述内标引物NS5-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于消除假阴性的寨卡病毒环介导恒温荧光检测引物组，其特征在于，所述检测引物组包含外引物对NS5-F/NS5-B、内引物对NS5-FIP/NS5-BIP、环引物对NS5-LF/NS5-LB和内标引物NS5-P，所述外引物对、内引物对和环引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1～6所示，所述内标引物NS5-P为含有荧光基因和淬灭基因的荧光探针，所述内标引物NS5-P的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。


2.一种寨卡病毒反转录环介导恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括权利要求1或2所述的恒温荧光检测引物组。


3.根据权利要求3所述的寨卡病毒反转录环介导恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述外引物对NS5-F/NS5-B、内引物对NS5-FIP/NS5-BIP、环引物对NS5-LF/NS5-LB的摩尔比为1～2：4～8：2～4。


4.根据权利要求4所述的寨卡病毒反转录环介导恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括DNA聚合酶、RNA反转录酶、内标、反应液、阳性对照和阴性对照。


5.根据权利要求5所述的寨卡病毒反转录环介导恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张影，陈皇佑，高芳，刘美贤，
申请(专利权)人：广州迪澳生物科技有限公司，广州迪澳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44