用于LKB1基因突变检测的引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于LKB1基因突变检测的引物及其应用。本发明专利技术设计了LKB1第8号外显子(LKB1‑E8)的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分；与现有技术相比，本发明专利技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

Primers for LKB1 gene mutation detection and their application

【技术实现步骤摘要】
用于LKB1基因突变检测的引物及其应用
本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及用于LKB1基因突变检测的引物及其应用。
技术介绍
人LKB1(LiverkinaseB1)基因或称STK11(Serine-ThreonineKinase11，STK11)，定位于人染色体19p13.3的位置。含10个外显子，编码蛋白LKB1由433个氨基酸组成,分子量约50kda，包括激酶区域(44～309)，N端调节域和C端调节域。N端调节域含一个核定位序列，使LKB1定位于细胞核中。LKB1在人体多种组织中广泛表达。以幼肝，睾丸，小肠和骨骼肌最多。LKB1基因的胚系失活突变可导致癌症易感病皮杰氏综合征(Peutz-Jegherssyndrome,PJS)，该病患者多发错构瘤息肉且患癌症风险增加。LKB1基因的体细胞突变广泛地存在于众多类型的恶性肿瘤中，如肺癌、结肠癌和乳腺癌等，因此，LKB1被普遍认为是抑癌基因。LKB1基因的编码产物LKB1蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，调节多种细胞生理病理过程。LKB1的直接底物包括AMPK(AMP-activatedproteinkinase)和十二种AMPK激酶。LKB1通过促进AMPKα亚基上Thr172位点的磷酸化，增强AMPK的磷酸化水平，从而使AMPK激活。LKB1可以通过激活AMPK来抑制真核细胞生长正调节因子mTORC1(mammaliantargetofrapamycincomplex1)的活性，而mTORC1可促进细胞生长和细胞周期的进程。在许多肿瘤细胞中，mTORC1的活性都被异常激活。LKB1激活AMPK后，AMPK可快速失活脂酸和胆固醇合成限速酶—乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase，ACC)和HMG-辅酶A还原酶(HMGCR)从而抑制脂类合成，降低能量消耗。同时快速调节糖酵解关键酶6-磷酸果糖激酶活性而促进糖酵解产生能量。ACC等酶类是一些肿瘤细胞生存所必须的，化学抑制其活性可抑制癌症和前列腺癌移植瘤的生长。LKB1基因位点的突变与很多肿瘤的发生发展相关，包括肺癌、结肠癌和乳腺癌等，这些位点上的突变是细胞恶性转化及可能的肿瘤产生的预兆，应引起高度重视。因此，关于LKB1基因位点突变的检测有着非常重要的作用。众所周知，高分辨熔解曲线(high-resolutionmelt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。而，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸：它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法；使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。SYBRTMGreenI对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。与此同时，罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LCGreen，它有三个优点：1、饱和染料毒性低；2、浓度可以使DNA达到饱和；3、降低了染料位置重组的可能。而，PCR(PolymeraseChainReaction)产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求:仪器:高分辨率高、均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响；试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线；软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件。罗氏荧光定量PCR系统LightCyclerNanoSystem具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。LightCyclerNanoSystem是LightCycler480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等影响因子10分以上5篇，包括Nature,NatureMethods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；第二：耗时长，一般需要2-3天；第三：成本高。鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的LKB1基因突变的快速检测方法，以及用于LKB1基因突变检测的引物开发是势在必行的。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种用于LKB1基因突变检测的引物及其应用。基于本申请的用于LKB1基因突变检测的引物，可以进行LKB1基因突变的快速检测，以解决现有测序法存在的缺点：第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；第二：耗时长，一般需要2-3天；第三：成本高。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术首先提供用于LKB1基因突变检测的引物，包括LKB1第8号外显子(LKB1-E8)的野生型引物和突变型引物；其中，LKB1第8号外显子的野生型引物的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，LKB1第8号外显子的野生型引物的反向引物序列如SEQIDNO.2所示，LKB1第8号外显子的突变型引物的正向引物序列如SEQIDNO.3所示，LKB1第8号外显子的突变型引物的反向引物序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供所述用于LKB1基因突变检测的引物在制备检测LKB1基因突变的检测试剂或检测LKB1基因突变的检测试剂盒中的应用。本专利技术还提供所述用于LKB1基因突变检测的引物进行非诊断目的的LKB1基因突变的快速检测方法，包括如下步骤：针对LKB1第8号外显子突变位点两端分别设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物以两个突变片段为模板进行PCR扩增，得到突变型模板，扩增对应的突变型模板；不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分。PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。高TmG:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm。纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线，杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线；其中，纯合子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于LKB1基因突变检测的引物，其特征在于，包括LKB1第8号外显子(LKB1-E8)的野生型引物和突变型引物；/n其中，LKB1第8号外显子的野生型引物的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，/nLKB1第8号外显子的野生型引物的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，/nLKB1第8号外显子的突变型引物的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，/nLKB1第8号外显子的突变型引物的反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于LKB1基因突变检测的引物，其特征在于，包括LKB1第8号外显子(LKB1-E8)的野生型引物和突变型引物；
其中，LKB1第8号外显子的野生型引物的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，
LKB1第8号外显子的野生型引物的反向引物序列如SEQIDNO.2所示，
LKB1第8号外显子的突变型引物的正向引物序列如SEQIDNO.3所示，
LKB1第8号外显子的突变型引物的反向引物序列如SEQIDNO.4所示。


2.权利要求1所述用于LKB1基因突变检测的引物在制备检测LKB1基因突变的检测试剂或检测LKB1基因突变的检测试剂盒中的应用。


3.基于权利要求1所述用于LKB1基因突变检测的引物进行非诊断目的的LKB1基因突变的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
针对LKB1第8号外显子突变位点两端分别设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物以两个突变片段为模板进行PCR扩增，得到突变型模板，扩增对应的突变型模板；
不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分。


4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。


5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线，杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线；
其中，纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子。


6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述不同比例混合野生型模板和突变型模板是指：使突变型模板的含量为1/10、1/1...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭南求，陈林军，钱芝网，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31