一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh制造技术

本发明专利技术公开一种生物转化三七总皂苷制备20(

Preparation of 20 (R) - ginsenoside RH by biotransformation of total saponins of notoginseng

【技术实现步骤摘要】
一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法
本专利技术涉及一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法，利用微生物产生的特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂，将三七总皂苷中高含量的主皂苷的糖基侧链进行选择性水解，制备20(R)-人参皂苷Rh1。
技术介绍
现代药理学研究表明，三醇型20(R)-人参皂苷Rh1具有广泛的生物活性，尤其在抗肿瘤方面效果显著，对人黑色素瘤细胞(A375-S2)、人子宫癌细胞(HeLa细胞)、人胎儿胶质细胞瘤细胞(T98G细胞)、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7细胞活性均有抑制作用；还有研究表明20(R)-人参皂苷Rh1可诱导宫颈癌Hela细胞系和白血病K562细胞系的细胞凋亡，其抗癌效果明显，如通过抑制MMP-9的表达进而抑制PMA诱导的人结直肠癌细胞SW480细胞的迁移和侵袭。另外，20(R)-人参皂苷Rh1在缓解肾组织纤维化，改善肾功能，抗炎，增强机体的免疫功能，保护神经细胞，保护心脑血管，降低缺血引起的心肌损伤，改善记忆方面也有显著效果。还有研究表明，20(R)-人参皂苷Rh1可抑制脂肪细胞3T3-L1细胞的成脂分化，预防肥胖。此外，20(R)-人参皂苷Rh1可明显促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成，有效改善皮肤皱纹，具有抗皮肤老化的作用。因其结构复杂，化学合成尚不可行，需从三七、人参、绞股蓝等植物中提取获得，但因植物中含量较低，且植物资源有限，为此，利用丰富的三七总皂苷获得大量20(R)-人参皂苷Rh1的方法更加简便可行。为了获得具有极高药用价值的人参稀有皂苷，从上世纪八十年代始，国内外化学及生物技术工程研究人员便开始了人参皂苷的结构改造工程，其研究目标主要锁定在利用不同方法对人参二醇型皂苷和三醇型皂苷中与其苷元相连的糖基侧链的结构修饰和改造上，使药材中含量较高的人参皂苷的糖基侧链经过水解反应，定向转化为稀有人参皂苷，目前，对于人参皂苷糖基侧链的结构修饰和改造的主要方法有化学法和微生物转化法。塔宾曲霉（Aspergillustubingensis）是从紫茎泽兰中分离的内生菌，此菌在自然界中分布较广，还能从土壤、哈密瓜、伞菌、牛粪等资源中分离得到。由于该真菌中含有丰富的酶系，可以促进天然产物结构的改造，所以能够高效降解聚氨酯塑料。
技术实现思路
本专利技术提供一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法，利用塔宾曲霉（Aspergillustubingensis）生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1，是一种绿色、高效、专一的制备高纯度稀有人参皂苷的发酵方法，克服了现有发酵过程中周期过长，发酵产物不稳定，不易纯化的缺点。本专利技术的技术解决方案如下：一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法，具体步骤如下：（1）取4℃斜面保藏的塔宾曲霉（Aspergillustubingensis）进行活化培养：将保藏于试管斜面上的菌株接种到含150mL灭菌后的培养基的250mL锥形瓶内；摇床培养3～5d，控温25～28℃，转速150～170r·min-1，得到菌株的种子液；（2）将步骤（1）的种子液接种到灭菌后的培养基中进行扩大培养，种子液的接种量占培养基质量百分比的0.02%～2.00%，摇床培养3～5d，得菌悬液；（3）按三七总皂苷为步骤（2）菌悬液质量的0.02～2.00%取三七总皂苷，与灭菌纯净水按照质量比1:2～1:4混合，超声充分溶解；在无菌条件下，将三七总皂苷溶液过无菌滤膜，并于无菌条件下将滤液加入步骤（2）的菌悬液中，继续摇床培养6～12d；（4）步骤（3）培养发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声10～30min，减压抽滤，分离发酵液与菌丝体，浓缩抽滤后的发酵液，发酵液和菌丝体分别用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并正丁醇相，减压蒸发浓缩，得到富含20(R)-人参皂苷Rh1的转化产物。步骤（1）和步骤（2）的培养基为PDB培养基或马丁氏培养基，其配制方法如下：PDB培养基：取200g新鲜市售马铃薯，切成边长为1cm的正方形马铃薯块，加纯净水1000mL加热30～50min至沸腾，用4层纱布过滤，用纯净水定容至1L，每升加20g葡萄糖，混匀分装灭菌备用；培养基灭菌条件：121℃，30min；马丁氏培养基：KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，纯净水定容至1L，混匀分装灭菌备用，培养基灭菌条件：121℃，30min。本专利技术的转化过程中亦可采用该菌的粗酶进行催化转化，将步骤（3）中菌悬液替换为塔宾曲霉菌粗酶液，摇床转化1～2d，转化产物经D101大孔树脂依次用水、体积分数30%乙醇水溶液、体积分数50%乙醇水溶液、体积分数70%乙醇水溶液、体积分数90%乙醇水溶液、纯乙醇进行洗脱，得到四个组分A-D，组分C再经硅胶柱层析依次用体积比30:1、20:1、10:1、1:5的二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，得六个亚组分C1-C6，亚组分C3经高压液相制备色谱用100:5～64:36的水/乙腈梯度洗脱，得化合物20(R)-人参皂苷Rh1。所述塔宾曲霉菌粗酶液的制备方法：将步骤（2）的菌悬液5000～12000r·min-1离心10min，采用醇沉法分离得到粗酶，具体操作是将上清液添加2～4倍无水乙醇混合后，放置冰浴30min，待粗酶充分析出后，10000～12000r·min-1离心获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.1～3.0L的比例，用pH=6.0～7.0的磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀，得到塔宾曲霉菌粗酶液。所述三七总皂苷为五加科人参属植物三七的主根经粉碎后，用体积分数70%的甲醇超声提取，提取液过滤浓缩后采用D101大孔吸附树脂经体积分数70%乙醇洗脱至无色，干燥获得三七总皂苷。本专利技术塔宾曲霉转化三七总皂苷后，经TLC检测发现，原来在三七总皂苷中含量较高的人参皂苷Rg1不见了，却出现了含量较高的20(R)-人参皂苷Rh1，根据二者的结构及含量变化，推测人参皂苷Rg1在塔宾曲霉的转化下水解脱糖转变成了20(R)-人参皂苷Rh1，其结构式如下：本专利技术主要利用塔宾曲霉（Aspergillustubingensis）中的酶对三七总皂苷进行生物转化，它对三七总皂苷的利用相对专一，转化率较高，通过正丁醇萃取的产物富集方式能够有效规避真菌发酵过程中产生的次级代谢产物，通过减压抽滤，能够有效分离菌丝和孢子，提高稀有皂苷的分离富集。本专利技术方法既可以制备单体稀有人参皂苷，也可以直接利用转化产物的粗提物来进行产品的开发，达到简单、高效、安全、绿色、成本低的加工目的，为工业化生产、食品生产和新药制备提供新保证。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。实施例1利用塔宾曲霉（As本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物转化三七总皂苷制备20(

【技术特征摘要】
1.一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将保藏于4℃试管斜面上的塔宾曲霉菌株接种到含150mL灭菌后的培养基中；摇床培养3～5d，控温25～28℃，转速150～170r·min-1，得到菌株的种子液；
（2）将步骤（1）的种子液接种到灭菌后的培养基中进行扩大培养，种子液的接种量占培养基质量百分比的0.02%～2.00%，摇床培养3～5d，得菌悬液；
（3）按步骤（2）菌悬液质量的0.02～2.00%取三七总皂苷，与灭菌纯净水按照质量比1:2～1:4混合，超声充分溶解；在无菌条件下，将三七总皂苷溶液过无菌滤膜，并于无菌条件下将滤液加入步骤（2）的菌悬液中，继续摇床培养6～12d；
（4）步骤（3）培养发酵结束后，超声10～30min，减压抽滤，分离发酵液与菌丝体，浓缩抽滤后的发酵液，发酵液和菌丝体分别用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并正丁醇相，减压蒸发浓缩，得到富含20(R)-人参皂苷Rh1的转化产物。


2.根据权利要求1所述生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）的培养基为PDB培养基或马丁氏培养基，其配制方法如下：
PDB培养基：取200g新鲜市售马铃薯，切成边长为1cm的正方形马铃薯块，加纯净水1000mL加热至沸腾，用4层纱布过滤，用纯净水定容至1L，每升加20g葡萄糖，混匀分装灭菌备用；培养基灭菌条件：121℃，30min；
马丁氏培养基：KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓艳，李瑞婷，崔秀明，曲媛，杨野，刘迪秋，王承潇，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53