一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法技术

本申请提供了一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，属于生物及抗体工程领域。本申请提供的分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，通过初次免疫后，结果几次加强免疫后，就能得到可以产生效价较高的脾细胞，通过脾细胞与骨髓瘤细胞融合，就能产生技能持续产生效价高，又能持续分裂增殖的杂交瘤细胞。

Preparation and screening of hybridoma cells secreting Axl antibody

【技术实现步骤摘要】
一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法
本申请涉及生物及抗体工程领域，具体而言，涉及一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法。
技术介绍
AXL属于Tyro-3家族的受体酪氨酸激酶，又称Ark、UFO或Tyro-7。其配体为Gas6，Gas6是一种分子量为70kDa的蛋白质，与抗凝因子S同源。AXL结合配体并激活后，会引起一系列的信号级联，导致PI3K-Akt以及Ras/Erk和β-catenin/TCF通路的激活。AXL在多种肿瘤组织中异常高表达，比如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、胸腺肿瘤、食管肉瘤、慢性髓淋巴瘤、急性髓系淋巴瘤、黑素瘤以及头颈部肿瘤中有高表达。已有研究表明AXL在侵袭性很强的乳腺癌中异常高表且与肿瘤迁移高度相关。体外实验证实肿瘤组织的迁移和侵袭依赖于AXL的活性，而采用抗体治疗抑制这种活性则可以抑制其活性(WO04008147)。同样，在体内抑制AXL，如表达一种无活性的AXL或采用siRNA抑制AXL的表达，则可以有效的阻断了小鼠体内移植瘤的生长。迄今，已有几种AXL抗体开发用于临床治疗，如美国专利公开号为US20190352407A1，有的AXL抗体还制备成药物偶联抗体形式如中国专利CN110536703A，用于直接杀伤肿瘤组织。我们认为AXL是一个在多种肿瘤组织中高表，且在肿瘤的发生、发展过程中作为主要驱动者，其药物开发潜力尚未被完全释放。主要原因如下：其一，现有抗体其阻断功能不高；其二，依赖欧联药物对肿瘤进行杀伤的策略，可能会因潜在毒性限制其应用范围。基于这一推断，筛选获得具有较高阻断活性的抗体，并通过基因工程手段，探索除ADC策略之外的治疗手段，具有潜在的成药优势，可能会为未被满足的临床需求提供可选的解决方案。
技术实现思路
本申请的公开了一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，制备方法包括以下步骤：采用AXL免疫原混合物50μg注射免疫小鼠，检测抗体效价，抗体效价达到106，停止免疫；取小鼠脾脏，制备成脾细胞液；将脾细胞液与骨髓瘤细胞液在40℃水浴条件下加入PEG溶液进行融合，离心得到杂交瘤细胞混合物；重悬杂交瘤细胞混合物；包被AXL抗原，加入杂交瘤细胞混合物孵育1h，洗涤拍干后加入二抗孵育并拍干，终止反应筛选得到阳性的分泌AXL抗体的杂交瘤细胞；并通过ELISA检测杂交瘤细胞的亲和力。在前述的一些实施例中，AXL免疫原混合物为AXL-mFc融合蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的质量比混合得到；检测抗体效价前还包括加强免疫3次加强免疫；加强免疫的免疫原采用AXL-mFc融合蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1的质量比混合得到；加强免疫间隔两周进行一次。在实施例中，用免疫原与弗氏完全佐剂对小鼠进行免疫后，再进行多次加强免疫，可以提高抗体的结合效果，提高产生的抗体与抗原的亲和力。在前述的一些实施例中，骨髓瘤细胞是SP20细胞，所述SP20细胞的浓度为1×107个/mL。在前述的一些实施例中，脾细胞与骨髓瘤细胞比例为3:1。在实施例中，通过过量的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，有利于脾细胞完全均能与骨髓瘤细胞融合。在前述的一些实施例中，PEG溶液预热至40℃。在实施例中，将PEG溶液也预热到40℃有利于细胞的融合，由于加热温度变高，细胞膜的流动性加强，脾细胞与骨髓瘤细胞就能融合加速。在前述的一些实施例中，重悬杂交瘤细胞混合物包括用20％的FBS培养基稀释细胞至5×104个/孔的浓度，在37℃，5％的CO2条件下培养7-10天。在前述的一些实施例中，包被AXL抗原的量为2μg/孔。在前述的一些实施例中，筛选得到阳性的分泌AXL抗体的条件为OD450值大于1。在前述的一些实施例中，检测杂交瘤细胞的亲和力的抗原用Gas6-His。在前述的一些实施例中，用0.5μg/mL的AXL-mFc与所述杂交瘤细胞按照1:1混合作为一抗。与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，通过初次免疫后，结果几次加强免疫后，就能得到可以产生效价较高的脾细胞，通过脾细胞与骨髓瘤细胞融合，就能产生技能持续产生效价高，又能持续分裂增殖的杂交瘤细胞。附图说明图1是实验例3的抗体结合实验图；图2是实验例4中抗体阻断实验结果图；图3是实验例5中流式细胞筛选实验结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，该制备筛选方法包括以下步骤：选择小鼠品系为BALA/C，6-8周龄的健康雌鼠。具体免疫操作步骤如下：1.1第一次免疫时采用弗氏完全佐剂，AXL-mFc免疫抗原(融合蛋白)与免疫佐剂(弗氏完全佐剂)比例为1:1，在免疫前只需将抗原和佐剂轻柔混合即可(注意：抗原和佐剂免疫前放在冰上)采用腹部皮下多点注射方式，每个点注射50μg；1.2间隔两周连续3次加强免疫：采用弗氏不完全佐剂，每个点注射30μg；1.3进行抗体效价检测，抗原AXL-hFc用包被液稀释，每孔包被1μg抗原；1.4以50μL/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃包被2小时；弃去孔内的液体，同时用洗涤液200μL洗3次，拍干；每孔加200μL封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时1.5洗涤液200μL洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用；每孔加50μL一抗(待检小鼠血清)，同时设立阳性、阴性对照孔；37℃孵育1h；洗涤液200μL洗5次，拍干；1.6加酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1h，洗涤液200μL洗5次，拍干；加底物液TMB50μL，37℃显色2～15min；以2mol/LH2SO4终止反应，酶标仪450nm读取OD值；观察结果，抗体效价达到10的6次方以上方可进行细胞融合。1.7间隔两周进行冲刺免疫，此时不加佐剂只用抗原进行腹腔免疫，每个点注射50μg，冲刺免疫3天后即可进行细胞融合实施例2本实施例进行脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，具体的操作步骤如下所示：1.1摘除一侧眼球放血后配合脊椎脱臼，处死的小鼠置于70％酒精；以镊子夹起小鼠左后肢股沟内侧的皮肤，以剪刀横剪，继而竖剪，或以手撕开，暴露系膜。股沟处若有淋巴结，可取下浸入10mLRMPI1640培养基(于9cm培养皿内)。小心的摘下脾脏，浸入上述培养基内，仔细剪除多余的白色脂肪或结缔组织，夹起并浸入新鲜的培养基，晃动洗脾1-2分钟；1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：/n采用AXL免疫原混合物50μg注射免疫小鼠，检测抗体效价，所述抗体效价达到10

【技术特征摘要】
1.一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
采用AXL免疫原混合物50μg注射免疫小鼠，检测抗体效价，所述抗体效价达到106，停止免疫；
取小鼠脾脏，制备成脾细胞液；将所述脾细胞液与骨髓瘤细胞液在40℃水浴条件下加入PEG溶液进行融合，离心得到杂交瘤细胞混合物；
重悬所述杂交瘤细胞混合物；
包被AXL抗原，加入所述杂交瘤细胞混合物孵育1h，洗涤拍干后加入二抗孵育并拍干，终止反应筛选得到阳性的分泌AXL抗体的杂交瘤细胞；并通过ELISA检测所述杂交瘤细胞的亲和力。


2.根据权利要求1所述分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，其特征在于，所述AXL免疫原混合物为AXL-mFc融合蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的质量比混合得到；
检测抗体效价前还包括加强免疫3次加强免疫；加强免疫的免疫原采用AXL-mFc融合蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1的质量比混合得到；加强免疫间隔两周进行一次。


3.根据权利要求1所述分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，其特征在于，所述骨髓瘤细胞是SP20细胞，所述SP20细胞的浓度为1×107个/mL。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：白先宏，
申请(专利权)人：百泰生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11