一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、靶向CD20的单链抗体、CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽。该双靶点嵌合抗原受体包括：信号肽、靶向CD19的单链抗体、靶向CD20的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够特异性识别CD19抗原或CD20抗原这两个单个靶点表达的肿瘤细胞，还可以识别CD19抗原和CD20抗原共同表达的肿瘤细胞，该双靶点的CAR‑T具有更强的抗肿瘤活性，能够避免低丰度抗原表达的阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了复发风险。

A double target chimeric antigen receptor targeting CD19 and CD20 and its expression vector and Application

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用
本专利技术涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400多万例，其中，血液肿瘤的发病率不断提高，发病年龄也有所提前，发病人群从过去的以中老年人居多，逐步扩散到年轻患者中，这可能与现代人生活压力大、环境污染加剧、生活习惯不健康等因素有关。嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)技术是近些年发展非常迅速的一种细胞治疗技术。目前，虽然在CD19CAR-T细胞取得了很大的成功，但是接受CD19CAR-T细胞治疗后的病患中，多达三分之二的患者会出现CD19表达丧失导致抗原逃逸、肿瘤细胞继续生长而表现癌症复发的情况。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用。所述技术方案如下：一方面，本专利技术提供了一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体，所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、靶向CD20的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示。具体地，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。进一步地，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：10所示。具体地，所述双靶点嵌合抗原受体还包括连接序列，所述连接序列连接在所述靶向CD19的单链抗体和所述靶向CD20的单链抗体之间，所述连接片段为(G4S)n或(EAAAK)n，n为1、2或3。进一步地，所述连接片段为(G4S)，n为1，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示。另一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述的双靶点嵌合体抗原受体。具体地，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。又一方面，本专利技术提供了一种上述的表达载体的应用，所述应用包括：将所述表达载体作为抗B细胞系恶性血液肿瘤的药物。具体地，所述抗B细胞系恶性血液肿瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供了一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，该双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、靶向CD20的单链抗体、CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够特异性识别CD19抗原或CD20抗原这两个单个靶点表达的肿瘤细胞，还可以识别CD19抗原和CD20抗原共同表达的肿瘤细胞，该双靶点的CAR-T具有更强的抗肿瘤活性，能够避免低丰度抗原表达的阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了复发风险。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例一提供的双靶点嵌合抗原受体的结构示意图；图2是本专利技术实施例二提供的双靶点嵌合抗原受体(CART02)的双酶切鉴定图；图3是本专利技术实施例二提供的慢病毒转染效率图；图4是本专利技术实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；图5是本专利技术实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；图6为本专利技术实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本专利技术实施例提供的双靶点嵌合抗原受体构建的CART02细胞对Raji细胞的杀伤能力，B为传统CD19CART细胞对Raji细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。实施例一本专利技术实施例提供了一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体，如图1所示，该双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽(人CD8α信号肽，CD8αleader)、靶向CD19的单链抗体(CD19scFv)、靶向CD20的单链抗体(CD20scFv)、加长的CD8α铰链区(人CD8α铰链区，CD8αHinge)、跨膜区(人CD8α跨膜区，CD8αtransmembrane)、共刺激因子和胞内信号肽(人CD3ζ胞内信号肽，CD3ζsignal)，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示。具体地，共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。在本实施例中，共刺激因子为4-1BB(4-1BBsignal)，且共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：7所示。具体地，双靶点嵌合抗原受体还可以包括连接序列(linker)，连接序列连接在靶向CD19的单链抗体和靶向CD20的单链抗体之间，连接片段为(G4S)n或(EAAAK)n，n为1、2或3。在本实施例中，连接片段为(G4S)n，n为1，连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示。从NCBI网站数据库搜索到人CD8α信号肽、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB的胞内区、人CD3ζ胞内信号肽的基因序列信息，靶向CD19和CD20的单链抗体的重链和轻链可变区，将上述序列在网站http：//sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、靶向CD20的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：5所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD19和CD20的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向CD19的单链抗体、靶向CD20的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述靶向CD20的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示。


2.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。


3.根据权利要求2所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：7所示。


4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张坤，
申请(专利权)人：华夏源上海细胞基因工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31