含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗技术

本发明专利技术提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域。该融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；狂犬病病毒G蛋白片段不含有狂犬病病毒G蛋白的跨膜区；GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该融合蛋白能够形成三聚体，结构接近天然狂犬病病毒G蛋白，免疫原性好。

Fusion protein containing rabies virus G protein and its preparation, application and vaccine

【技术实现步骤摘要】
含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病病毒(RabiesVirus,RV)引起的传染病，所有温血动物都能感染狂犬病病毒，人多因被患病的动物咬伤而感染，临床表现为特有的恐水、怕风、咽肌痉挛等。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，单股RNA病毒，动物通过互相间的撕咬而传播病毒。我国的狂犬病主要由犬传播，家犬可以成为无症状携带者，所以表面“健康”的犬对人的健康危害很大。对于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率几近100％，患者一般于3～6日内死于呼吸或循环衰竭，故应加强预防措施。国外的狂犬病防控经验表明，犬狂犬病疫苗免疫覆盖率达到75％，狂犬病的发病率即可得到有效控制。狂犬病疫苗目前包括传统灭活疫苗、弱毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗，目前弱毒活疫苗和重组活载体疫苗仅用于野生动物免疫。灭活狂犬病疫苗按照应用不同细胞培养工艺分为Vero细胞狂犬苗、地鼠肾细胞狂犬苗、二倍体细胞狂犬苗和鸡胚细胞狂犬苗。目前国内上市销售的人用狂犬病疫苗均为灭活疫苗，其中90％左右市场份额是Vero细胞狂犬苗。DNA残留量是Vero细胞特有的质控标准。Vero细胞几乎可以无限繁殖，可能具有致癌性，由于Vero细胞成分属于杂质，需要对Vero细胞疫苗设定杂质残留量标准。欧洲和世卫组织规定，Vero细胞狂苗DNA残留量≤10ng/剂，我国从2010版药典起规定，所有Vero细胞疫苗DNA残留量≤100pg/剂(1000pg＝1ng)，比欧洲和世卫组织的标准严格100倍。按照现有的技术水平，生产合格狂犬病灭活疫苗，对病毒培养和疫苗纯化要求高，企业生产成本高。由于2010版药典的严苛DNA残量标准，导致每年均有多批次Vero细胞狂犬苗不予签发。狂犬病弱毒活疫苗由于安全性问题，仅用于野生动物免疫。二倍体细胞狂犬苗和鸡胚细胞狂犬苗培养工艺很难实现规模化生产，产能不容易扩大，疫苗价格高，而且不同批间次的差异有时也会影响疫苗的质量。国内动物用狂犬病灭活疫苗由于种毒、培养工艺等原因，疫苗的成本对于大规模应用群体免疫，有一定的经济压力。国内宠物狂犬病疫苗份额常年被进口疫苗垄断，一方面是过去国内动物狂犬病疫苗品质差，得不到用户信任；另一方面进口疫苗附加值高，宠物店利润高。因此一种改进的狂犬病疫苗是目前市场需要的。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，该融合蛋白呈三聚体结构，具有较好的免疫原性。本专利技术的第二目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法，该方法操作简单，适合大规模生产。本专利技术的第三目的在于提供一种疫苗，该疫苗包含上述融合蛋白、编码该融合蛋白的基因和与融合蛋白相关的生物材料中的至少一种。为解决所述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，该融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的基因。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达所述融合蛋白和/或含有编码所述融合蛋白的基因。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了所述融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述融合蛋白的基因。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了所述融合蛋白、编码所述融合蛋白的基因、所述生物材料或所述制备方法在如下(x1)～(x4)中至少一种的应用：(x1)制备狂犬病疫苗；(x2)制备狂犬病病毒G蛋白抗体；(x3)制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒；(x4)制备狂犬病病毒G蛋白抗体检测试剂盒。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了一种疫苗，该疫苗包含所述融合蛋白、编码所述融合蛋白的基因和所述生物材料中的至少一种。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段，狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区，通过在去除跨膜区的狂犬病病毒G蛋白片段的羧基端融合具有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的GCN4片段，使去除了跨膜区的狂犬病病毒G蛋白片段形成三聚体，结构接近天然狂犬病病毒G蛋白结构，与天然狂犬病病毒G蛋白相似，增强融合蛋白的免疫原性。以含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白作为免疫原能够有效刺激机体产生中和抗体，从而抵抗狂犬病病毒感染。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例提供的融合蛋白的示意图；图2为本专利技术实施例提供的融合蛋白SDS-PAGE电泳结果；图3为本专利技术效果例中小鼠免疫后的体重变化；图4为本专利技术效果例中小鼠免疫后血清中VNA抗体含量的变化。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。所述试剂，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白。该融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有狂犬病病毒G蛋白的跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。狂犬病病毒糖蛋白G由524个氨基酸组成，是够诱导机体产生中和抗体的结构蛋白，免疫动物可以保护机体抵抗病毒的感染，是构建新型基因工程亚单位疫苗的首选靶蛋白。天然的狂犬病病毒糖蛋白G是以三聚体形式存在的跨膜蛋白，完整结构的三聚体狂犬病病毒糖蛋白能够有效诱导机体产生中和抗体，但是跨膜区的存在会导致蛋白沉淀，降低收率，而去除跨膜区的可溶性狂犬病病毒糖蛋白单体免疫原性会显著降低。本专利技术通过狂犬病病毒G蛋白片段的羧基端融合GCN4片段，使去除跨膜区的狂犬病病毒G蛋白片段能够形成三聚体结构，接近天然蛋白的构象，维持狂犬病病毒G蛋白的免疫原性。GCN4片段是一种亮氨酸拉链，亮氨酸拉链有利于与其融合的蛋白片段形成聚合体，可以使蛋白更有效地形成三聚体结构。在一些优选的实施方式中，狂犬病病毒G蛋白片段的核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白片段和融合于所述狂犬病病毒G蛋白片段羧基端的GCN4片段；所述狂犬病病毒G蛋白片段不含有跨膜区；所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述狂犬病病毒G蛋白片段的核苷酸序列为如SEQIDNO.2所示序列，或为以SEQIDNO.2所示序列为基础经密码子优化的序列。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述狂犬病病毒G蛋白片段和GCN4片段通过Linker连接；
优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；
优选地，所述融合蛋白还含有标签；
优选地，所述标签包括Strep-Tag；
优选地，所述融合蛋白的羧基端含有Strep-Tag标签。


4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由哺乳动物表达系统表达；
优选地，所述融合蛋白的信号肽为哺乳动物分泌信号肽；
优选地，所述哺乳动物分泌信号肽包括VSV-G分泌信号肽；
优选地，所述融合蛋白由CHO细胞表达；
优选地，所述融合蛋白由CHO-K1细胞表达。


5.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由氨基端至羧基端依次为VSV-G分泌信号肽、狂犬病病毒G蛋白片段、Linker、GCN4片段和Strep-Tag标签；
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；
优选地，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


6.编码权利要求1-5任一项所述融合蛋白的基因；
优选地，编码所述融合蛋白的基因为如SEQIDNO.5所示序列，或为和SEQIDNO.5所示序列90％以上同源性的序列。


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【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，张国庆，潘毅平，饶婷婷，李健友，张子墨，
申请(专利权)人：天康生物上海有限公司，天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31