一种普利卡那肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种普利卡那肽的的制备方法，本发明专利技术通过固相合成法制备普利卡那肽树脂、普利卡那肽树脂酸解得到普利卡那肽线性肽、普利卡那肽环化获得普利卡那肽粗品、普利卡那肽粗品纯化得到普利卡那肽精品。本发明专利技术方法所制备的普利卡那肽精品，纯度大于99.5%，单一杂质小于0.2%。与现有技术相比，本发明专利技术工艺大大降低了普利卡那肽的合成难度，提高了普利卡那肽的粗品纯度，在降低原料使用量的同时，大大降低了纯化的难度。具有广泛的实用价值和应用前景。

A method for the preparation of procanapeptide

【技术实现步骤摘要】
一种普利卡那肽的制备方法
本专利技术属于多肽药物制备领域，具体为一种普利卡那肽的制备方法。
技术介绍
普利卡那肽是Synergy制药公司开发的一种鸟苷酸环化酶C(GC-C)受体激动剂，于2017年1月被FDA批准用于慢性特发性便秘的治疗。其治疗机理与利那洛肽相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠蠕动。普利卡那肽为一类新的口服制剂，无需注射即可直接口服使用，可为众多患者接受。普利卡那肽的CAS号：467426-54-6，英文名Plecanatide，其序列如下：专利公开号为CN103694320B，其采用的固相方法合成线性多肽树脂，裂解后获得普利卡那肽线性肽粗品，此后经过两步法环化得到普利卡那肽粗品。由于该方法成环在溶液中分两次进行，且第一为Cys(tBu)保护的巯基用双氧水氧化，其氧化效果非常差，造成普利卡那肽的粗品纯度低，分离纯化难度大。很难进行工业化生产。南京工业大学的专利(CN104628827A)，采用固相树脂上两步氧化法获得成环的普利卡那肽树脂，经裂解后获得普利卡那肽粗品，经纯化获得普利卡那肽精品。此方法采用固相上进行环化，其环化效果不佳，造成分离纯化困难。亦很难进行工业化生成。另外，在实际生产过程中，普利卡那肽不仅存在环化后纯度低的问题，而且存在严重的缩聚现象，造成线性肽合成困难。我们也尝试了多种方法用于改善树脂的缩聚问题。我们采用各种离子对试剂干扰氢键的形成。其效果不理想。
技术实现思路
针对普利卡那肽在合成过程中出来的树脂缩聚而造成合成困难的问题，本专利技术旨在提供一种普利卡那肽的制备方法，本专利技术工艺稳定，且杂质含量低、收率高，适合于大规模工业化生成。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种普利卡那肽的的制备方法，通过固相多肽合成法制备普利卡那肽树脂，普利卡那肽树脂酸解得到普利卡那肽线性肽，普利卡那肽环化获得普利卡那肽粗品，普利卡那肽粗品纯化得到普利卡那肽精品；其中固相多肽合成法制备普利卡那肽树脂的方法为：在Fmoc-Leu-树脂上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基酸或片段，制得普利卡那肽线性肽树脂，R1-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(R2)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(R3)-Val-Asn(Trt)-X-Cys(R2)-Y-Cys(R3)-Leu-树脂，其中R1为Fmoc或Boc或H；X为：Val-(Hmb)Ala或Val-(Dmb)Ala或Val-Ala；Y为：Thr(R4)-(hmb)Gly或Thr(R4)-(Dmb)Gly，其中R4为Trt或tBu；R2和R3选自：Acm、Trt、tBu、MeBzl、MeOBzl、Bzl、Tacm、Mmt，其中，Acm为乙酰氨甲基、Trt为三苯甲基、tBu为叔丁基、MeBzl为对甲基苄基、MeOBzl为对甲氧基苄基、Bzl为苄基、Tacm为新戊酰氨甲基、、Mmt为4-甲氧基三苯甲基；R2和R3为同一种保护基或不同的保护基。作为对上述技术方案的补充和完善，本专利技术还包括以下技术特征。接入X片段的步骤如下：用1次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Val-(Hmb)Ala-OH或Fmoc-Val-(Dmb)Ala-OH；或用2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-(Hmb)Ala-OH或Fmoc-(Dmb)Ala-OH或Fmoc-Ala-OH，第二次为Fmoc-Val-OH。接入Y片段的步骤如下：用1次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Thr(R4)-(hmb)Gly-OH或Fmoc-Thr(R4)-(Dmb)Gly-OH；或用2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-(Dmb)Gly-OH，第二次为Fmoc-Thr(R4)-OH。其中，上述Fmoc为9-芴甲氧羰基、Trt为三苯甲基、Boc为叔丁氧羰基、OtBu为叔丁氧基、tBu为叔丁基。接入X以外的其它保护氨基酸分别为：Fmoc-Asn(Trt)-OH或Boc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Cys(R2)-OH或Fmoc-Cys(R3)-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Val-OH。其中Boc-Asn(Trt)-OH仅可用于最后一个氨基酸的偶联。接入各个保护氨基酸或片段时，其用量为载体树脂总摩尔数的1～9倍，优选2-4倍。所述的Fmoc-Leu-树脂是将树脂与Fmoc-Leu-OH偶联所得，所述的Fmoc-Leu-树脂其Fmoc-Leu取代值为0.1～1.5mmol/g树脂，优选的Fmoc-Leu取代值为0.3～0.8mmol/g树脂。所述的载体树脂为羟基类型树脂或Trityl-Cl类型树脂，其中羟基类型树脂优选为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP）树脂；Trityl-Cl类型树脂为Trityl-Cl树脂、4-MethylTrityl-Cl树脂、4-MethoxyTrityl-Cl树脂或2-ClTrity-Cl树脂。所述固相偶联合成法是：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护后，再与下一个保护氨基酸偶联反应，偶联反应时间为30～300分钟，优选为60-120分钟。上述偶联时，需要添加缩合试剂和活化试剂，缩合试剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)。优选的为DIC。上述脱去Fmoc保护的试剂为10~30%（V/V）哌啶(PIP)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，优选的为20%（V/V）。使用的去保护试剂用量为每克投料树脂5-15ml，优选为每克投料树脂8ml。去保护反应时间为5~60分钟，优选为15~25分钟。活化试剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)，优选的为1-羟基苯并三唑(HOBt)。缩合试剂和活化试剂的摩尔用量与氨基酸的摩尔用量一致。普利卡那肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到普利卡那肽的线性肽粗品：H-Asn-Asp-Glu-Cys(R2)-Glu-Leu-Cys(R3)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(R2)-Thr-Gly-Cys(R3)-Leu-OH，其中R2或/和R3为Trt或Mmt保护基时，可以在切割过程中被酸解；如果为其它保护基时，其不能被酸解。普利卡那肽树脂酸解时采用的酸解试剂为：三氟醋酸（TFA）、1，2-乙二硫醇（EDT）、三异丙基硅烷（Tis）、苯酚和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比例为80-95（V/V），EDT的比例为0.5-5%（V/V），Tis的比例为0-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普利卡那肽的的制备方法，其特征在于：通过固相多肽合成法制备普利卡那肽树脂，普利卡那肽树脂酸解得到普利卡那肽线性肽，普利卡那肽环化获得普利卡那肽粗品，普利卡那肽粗品纯化得到普利卡那肽精品；其中固相多肽合成法制备普利卡那肽树脂的方法为：在Fmoc-Leu-树脂上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基酸或片段，制得普利卡那肽线性肽树脂，/nR1-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(R2)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(R3)-Val-Asn(Trt)-X-Cys(R2)-Y-Cys(R3)-Leu-树脂，其中R1为Fmoc或Boc或H；X为：Val-(Hmb)Ala或Val-(Dmb)Ala或Val-Ala；Y为：Thr(R4)-(hmb)Gly或Thr(R4)-(Dmb)Gly，其中R4为Trt或tBu；R2和R3选自：Acm、Trt、tBu、MeBzl、MeOBzl、Bzl、Tacm、Mmt；R2和R3为同一种保护基或不同的保护基。/n

【技术特征摘要】
1.一种普利卡那肽的的制备方法，其特征在于：通过固相多肽合成法制备普利卡那肽树脂，普利卡那肽树脂酸解得到普利卡那肽线性肽，普利卡那肽环化获得普利卡那肽粗品，普利卡那肽粗品纯化得到普利卡那肽精品；其中固相多肽合成法制备普利卡那肽树脂的方法为：在Fmoc-Leu-树脂上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基酸或片段，制得普利卡那肽线性肽树脂，
R1-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(R2)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(R3)-Val-Asn(Trt)-X-Cys(R2)-Y-Cys(R3)-Leu-树脂，其中R1为Fmoc或Boc或H；X为：Val-(Hmb)Ala或Val-(Dmb)Ala或Val-Ala；Y为：Thr(R4)-(hmb)Gly或Thr(R4)-(Dmb)Gly，其中R4为Trt或tBu；R2和R3选自：Acm、Trt、tBu、MeBzl、MeOBzl、Bzl、Tacm、Mmt；R2和R3为同一种保护基或不同的保护基。


2.根据权利要求1所述的一种普利卡那肽的的制备方法，其特征在于：接入X片段的步骤如下：用1次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Val-(Hmb)Ala-OH或Fmoc-Val-(Dmb)Ala-OH；或用2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-(Hmb)Ala-OH或Fmoc-(Dmb)Ala-OH或Fmoc-Ala-OH，第二次为Fmoc-Val-OH。


3.根据权利要求1所述的一种普利卡那肽的的制备方法，其特征在于：接入Y片段的步骤如下：用1次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Thr(R4)-(hmb)Gly-OH或Fmoc-Thr(R4)-(Dmb)Gly-OH；或用2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-(Dmb)Gly-OH，第二次为Fmoc-Thr(R4)-OH。


4.根据权利要求1-3任一项所述的一种普利卡那肽的的制备方法，其特征在于：接入X以外的其它保护氨基酸分别为：Fmoc-Asn(Trt)-OH或Boc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Cys(...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑渊，王升武，
申请(专利权)人：杭州肽佳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33