一种区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标记物制造技术

本发明专利技术涉及一种用于区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标志物，所述的分子标志物是GAS8‑AS1的RNA序列片段，所述的RNA片段如SEQ ID No.2所示，所述的RNA序列片段的编码DNA序列如Seq ID No.1所示。本发明专利技术还涉及所述的DNA片段RNA片段在制备区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的检测试剂或试剂盒中的应用。

A molecular marker for distinguishing papillary thyroid carcinoma from benign thyroid nodule

【技术实现步骤摘要】
一种区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标记物
本专利技术属于医药生物
，具体的，涉及一种区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标记物及检测试剂盒。
技术介绍
甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤，发病率在全球范围持续攀升。美国近10年间，甲状腺癌发病率上升209％，在中国甲状腺癌发病率在女性中已经超过子宫内膜癌及卵巢癌，成为前十位高发癌症,增长速度之快令人堪忧。甲状腺癌依据病理类型可分为甲状腺乳头状癌(Papillarythyroidcarcinoma，PTC)、滤泡状癌、髓样癌以及未分化癌，其中甲状腺乳头状癌最为常见，约占80％左右。虽然大多数PTC预后良好，但少部分侵袭性强，术后很快出现转移(1-4％)或局部复发(5-20％)，并且预后极差。因此，早期识别肿瘤侵袭性，寻求针对肿瘤侵袭性的治疗靶点，是亟待解决的医学难题。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,LncRNA)的出现为肿瘤特性研究提供新思路。LncRNA是长度超过200个核苷酸、具有调控基因表达作用的非编码RNA，能直接与基因表观遗传修饰位点相互作用，能作用与基因启动子区调控基因表达，或与mRNA结合影响蛋白质合成过程，亦可与蛋白直接结合，影响靶基因表达及功能，进而调控细胞凋亡、肿瘤浸润，影响肿瘤发生及预后，可作为肿瘤诊断及预后判定的分子标志物[6]。前列腺癌基因3(Prostatecancergene3,PCA3)[7]是早期发现的lncRNA肿瘤标志物的经典代表之一，是在前列腺中特异性表达的lncRNA，测定尿液中lncRNAPCA3在前列腺癌的诊断中，特异性和敏感性均优于传统的血浆前列腺癌特异性标志物--前列腺特异抗原PSA。近年来发现，PCA3的升高提示前列腺癌预后不良[8]。此外肝癌中高表达的lncRNAHighlyupregulatedinlivercancer(HULC)，诊断肝癌的ROC曲线下面积可高达0.86[9]，且HULC的升高程度与淋巴结转移、远处转移、AJCC后期等侵袭性征象呈正相关[10]。令人兴奋的是，PanW等人通过测序技术在PTC组织中发现了中国人群独有的突变基因LncRNAGAS8反义RNA1(antisenseRNA1,GAS8-AS1)(c.713A>G/714T>C)，突变频率为9.2％，仅次于BRAFv600e，成为中国人PTC中第二位突变基因。根据美国TCGA数据库资料显示，LncRNAGAS8-AS1的突变存在于白种人及黑人的肾上腺皮质癌中，且与中国人的PTC的突变频率接近，在肝癌、肺癌等多种其他癌症中几乎未检测到上述突变[14]。LncRNAGAS8-AS1是生长停滞特异性基因(growtharrestspecific8，GAS8)第2位内含子的转录产物，长达994nt，上述突变导致LncRNAGAS8-AS1表达水平明显下降。
技术实现思路
甲状腺乳头状癌与良性结节难以鉴别，缺乏相应的分子标志物，术前只能依靠细针穿刺细胞学诊断，但该诊断断的检验效能有待进一步提高，且为有创检查，风险高，接受度低，故研发甲状腺乳头状癌早期诊断的分子标志物势在必行。本课题组通过检测甲状腺乳头状癌及良性结节患者血浆中的lncRNAGAS8-AS1，发现癌症患者血浆中lncRNAGAS8-AS1明显低于良性结节组。基于此，本专利技术首先涉及一种用于区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标志物，所述的分子标志物是GAS8-AS1的RNA序列片段，所述的RNA序列片段的编码DNA序列如SeqIDNo.1所示，SeqIDNo.1：所述的RNA片段如SEQIDNo.2所示，SEQIDNo.2：本专利技术还涉及SEQIDNo.1所述的DNA片段或SEQIDNo.2所述的RNA片段在制备区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的检测试剂盒中的应用。本专利技术还涉及一种区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的检测试剂盒，所述的试剂盒包括：(1)检测有效量的SEQIDNo.1所述的DNA片段或SEQIDNo.2所述的RNA片段的特异性引物，(2)必要的显色及定量试剂。优选的，所述的检测SEQIDNo.1所述的DNA片段的引物序列如SEQIDNo.3和4所示，引物F：SEQIDNo.3：5’-GACAAGACAACGAGCAAACAAG-3’引物R：SEQIDNo.4：5’-GGAGCCTCTAAAGGTCTGTGAC-3’。本专利技术还涉及一种区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的方法，所述方法包括如下步骤：(1)空腹抽取患者全血，离心获得2ml血浆；(2)使用TRIZOL(Invitrogenlifetechnologies)法提取血浆中总RNA；(3)通过SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)及2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTestLtd)Primer(英骏生物技术有限公司)在GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)中进行逆转录反应，获得cDNA；(4)采用2XPCRmastermix(Arraystar)试剂盒，配成如下反应体系为2×MasterMix5μl，10uM引物F0.5μl，异引物R0.5μ，cDNA2ul，加水至总体积为10μl，将上述反应体系置于RealtimePCR(ViiA7Real-timePCRSystem，AppliedBiosystems)仪上进行PCR反应，使用的引物为SEQIDNo.3和4所示的引物。附图说明图1、RT-PCR结果表明甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节患者中，GAS8-AS1的表达差异明显(图1A、B)，同时，使用GAS8-AS1作为检测指标，能够很好的区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节。具体实施方式实施例1、目标人群中的GAS8-AS1的RNA序列片段检测1、空腹抽取患者全血，离心获得2ml血浆；2、使用TRIZOL(Invitrogenlifetechnologies)法提取血浆中总RNA；3、通过SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)及2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTestLtd)Primer(英骏生物技术有限公司)在GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)中进行逆转录反应，获得cDNA；4、采用2XPCRmastermix(Arraystar)试剂盒，配成如下反应体系为2×MasterMix5μl，10uM引物F0.5μl，异引物R0.5μ，cDNA2ul，加水至总体积为10μl，将上述反应体系置于RealtimePCR(ViiA7Real-ti本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标志物，所述的分子标志物是GAS8-AS1的RNA序列片段，所述的RNA片段如SEQ ID No.2所示，所述的RNA序列片段的编码DNA序列如Seq ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的分子标志物，所述的分子标志物是GAS8-AS1的RNA序列片段，所述的RNA片段如SEQIDNo.2所示，所述的RNA序列片段的编码DNA序列如SeqIDNo.1所示。


2.权利要求1所述的DNA片段RNA片段在制备区分甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节的检测试剂或试剂盒中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(1)检测有效量的SEQIDNo.1所述的DNA片段或SEQIDNo.2所述的RNA片段的特异性引物，
(2)必要的显色及定量试剂。


4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的检测SEQIDNo.1所述的DNA片段的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬雪，姜涛，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京世纪坛医院，
类型：发明
国别省市：北京;11