一种脐带间充质干细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种脐带间充质干细胞的分离方法：(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，剪成小段，剥离组织，放于组织消化液中，将小段剪成组织块，加入氯化钙溶液，37℃消化45分钟，每隔15分钟取出吹打，混匀；(2)将含组织块的消化产物过筛进行过滤：过滤前先用无血清培养基浸湿网筛，过滤时将含组织块的消化产物逐渐滴加过滤，过滤后用无血清培养基冲洗网筛，得到比较充分的组织块和单细胞悬液；(3)将组织块和单细胞悬液离心，培养，得脐带间充质干细胞。第3天已经有很多细胞，7～8天，生长迅速，细胞处于对数生长期，细胞融合度能达到95～100％。后期进行成肌/成脂诱导分化，原代细胞分化程度很高，且细胞状态良好。

A method for isolation of cord mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞的分离方法
本专利技术涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法，属于细胞分离培养

技术介绍
间充质干细胞((MesenchymalStemCells，MSCs)，起源于中胚层，是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可在体外诱导分化为肌肉、脂肪、骨、神经等各种组织细胞。MSCs根据其本身的特点在血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、关节损伤修复、自身免疫疾病等方面有广阔的应用。随着技术和经济的发展，脐带间充质干细胞不仅在疾病方面有重大突破，在美容抗衰老行业也已经开始应用。人体的衰老实质上是细胞的衰老，补充间充质干细胞，让其在体内更新代谢，可以抑制衰老的过程。目前MSCs在临床上的应用主要来源于骨髓和脐带。成年人骨髓中的MSCs量少，取材痛苦复杂，还要注意感染的风险，相比而言，脐带来源丰富，采集简单，对母亲和新生儿无任何不良影响，MSCs数量多，增殖能力强，基因稳定，免疫原性低，具有免疫调节功能，对供着无排斥反应。现有技术中，脐带间充质细胞分离的主要方法有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法一般采用的是先后用胰酶和Ⅰ型胶原酶等体积加入过夜消化脐带组织，将离心弃上清后产物直接接种于培养瓶中。其弊端是：消化时间过长，可能会影响细胞活性，而且消化时间过长酶可能将一些其它细胞消化完全，导致铺板细胞纯度偏低。组织块贴壁法是将新鲜脐带清洗干净，用手术剪将其剪成2～3mm3的小块，放到被包被过的培养皿中，添加培养基，不断换液，一般需要14～20天细胞密度才可达到传代水平。该方法操作简便，经济成本低，其弊端是：组织块没有去除表皮和血管内皮等细胞，导致获得分离培养的原代间充质干细胞培养周期长，而且直接将组织块贴壁培养，待细胞密度达到传代水平就将脐带组织弃掉，未充分利用脐带组织。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞的分离方法，本专利技术利用胶原酶消化法，优化脐带间充质干细胞的分离方法，提高了分离效率。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种脐带间充质干细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，剪成(用手术剪)小段，剥离组织，放于组织消化液中，将小段剪成1mm3的组织块，加入终浓度至0.36mM的氯化钙溶液(激活酶充分发挥作用)，37℃消化45分钟(置于37℃恒温空气浴摇床中)，消化期间每隔15分钟取出吹打，混匀；所述组织消化液，由Ⅳ型胶原酶和无血清培养基组成，其中，Ⅳ型胶原酶的浓度为1mg·mL-1；(2)消化结束后，将含组织块的消化产物依次过8目筛、10目筛进行过滤：过滤前先用无血清培养基(1mL)浸湿网筛，过滤时将含组织块的消化产物逐渐滴加过滤，过滤后用无血清培养基(2～3mL)冲洗网筛，得到比较充分的组织块和单细胞悬液；(3)将组织块和单细胞悬液离心，培养(0.5～1.5个组织块/cm2密度接种到75cm2培养瓶)，得脐带间充质干细胞，显微镜下观察，第3天已经有很多细胞，7～8天时细胞很多，生长迅速，且状态很好。本专利技术的脐带间充质干细胞的分离方法，效率高，操作简单，能充分利用宝贵的脐带组织，在短时间内获得数量多、质量好的间充质干细胞。本专利技术在组织消化上有所改进，利用的是Ⅳ型胶原酶，在剪小组织块后加氯化钙溶液，作用是在消化过程中激活酶充分发挥作用，并且消化是在37℃恒温空气浴摇床中进行，共45分钟，期间每隔15分钟取出，混匀，避免在摇晃过程中组织聚成一团。与I型胶原酶和胰酶共同消化组织相比，不需要6～8小时甚至过夜的消化时间，只需将含有消化液的组织块在37℃恒温空气浴摇床中消化45min，过滤后就可以得到很充分的组织块和单细胞悬液，消化时间很短。从细胞角度而言：可降低因消化时间过长而损伤细胞的风险；降低因消化时间过长酶会将一些其它细胞消化，导致铺板细胞纯度偏低的可能。从成本角度而言：消化时间短，节约时间，不用包被培养板或者培养瓶，操作简便，节约经济成本,充分提高间充质干细胞的分离效率。本专利技术在过滤过程中有所改进，在过滤前先滴加无血清培养基，再进行过滤。因为消化产物较粘稠，直接过滤可能部分组织会黏住筛孔，过滤过程较慢，因此考虑过滤的时候先滴加无血清培养基以浸湿网筛，让组织块合适的消化产物很容易通过筛孔。待产物过滤完后，再滴加无血清培养基去冲洗残留在网筛上的消化产物，目的是将残留在网筛上的组织和细胞尽可能完全冲下去，避免过滤过程中的损失。将获得的产物根据0.5～1.5个组织块/cm2密度接种到75cm2培养瓶中，在培养至2天时可观察到组织块周围有很多细胞增殖；培养第4天时，细胞融合度能达到25％；在培养至6天时，细胞融合度能达到60％；在培养至8天时，细胞处于对数生长期，细胞融合度能达到95～100％。后期进行成肌/成脂诱导分化，原代细胞分化程度很高，且细胞状态良好。本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本专利技术所表述的含义为准。附图说明图1为原代细胞的生长曲线图。图2为原代细胞培养4天时的细胞形态图。图3为原代细胞培养6天时的细胞形态图。图4为原代细胞培养8天时的细胞形态图。图5为原代细胞成肌分化0天，2天，4天的细胞形态图，其中，A，B，C分别为0天，2天，4天。图6为原代细胞成脂分化4天，6天，8天的细胞形态图，中，A，B，C分别4天，6天，8天。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。本专利技术对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本专利技术目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本专利技术仍然在此作尽可能详细描述。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1分离并培养脐带间充质干细胞步骤如下(以下所有的操作都在无菌室完成，所有器械和耗材都是无菌的)：(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，小心剥离脐动脉和脐静脉，反复冲洗干净；用手术剪剪成1.5cm左右的小段，剥离组织，放于组织消化液中，用手术剪将小段剪成1mm3左右的组织块，加入终浓度至0.36mM的氯化钙溶液(激活酶充分发挥作用)，置于37℃恒温空气浴摇床中消化45分钟，消化期间每隔15分钟取出吹打，混匀；所述组织消化液，通过以下方法制备得到：将10mgⅣ型胶原酶溶解于10mL无血清的DMEM/F12培养基中，用0.22μm的除菌过滤器过滤，备用；(2)消化结束后，将含组织块的消化液依次过8目筛、10目筛进行过滤，具体操作是：在50mL的离心管上放本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，剪成小段，剥离组织，放于组织消化液中，将小段剪成组织块，加入氯化钙溶液，37℃消化45分钟，消化期间每隔15分钟取出吹打，混匀；/n所述组织消化液，由Ⅳ型胶原酶和无血清培养基组成；/n(2)消化结束后，将含组织块的消化产物过筛进行过滤：过滤前先用无血清培养基浸湿网筛，过滤时将含组织块的消化产物逐渐滴加过滤，过滤后用无血清培养基冲洗网筛，得到比较充分的组织块和单细胞悬液；/n(3)将组织块和单细胞悬液离心，培养，得脐带间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，剪成小段，剥离组织，放于组织消化液中，将小段剪成组织块，加入氯化钙溶液，37℃消化45分钟，消化期间每隔15分钟取出吹打，混匀；
所述组织消化液，由Ⅳ型胶原酶和无血清培养基组成；
(2)消化结束后，将含组织块的消化产物过筛进行过滤：过滤前先用无血清培养基浸湿网筛，过滤时将含组织块的消化产物逐渐滴加过滤，过滤后用无血清培养基冲洗网筛，得到比较充分的组织块和单细胞悬液；
(3)将组织块和单细胞悬液离心，培养，得脐带间充质干细胞。


2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将小段剪成1mm3的组织块。


3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中，，氯化钙...

【专利技术属性】
技术研发人员：任玲，赵俊伟，殷克然，周兴旺，蔡子梦，宋健，
申请(专利权)人：河北银丰鼎诚生物技术有限公司，银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13