一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法技术方案

本发明专利技术公开了一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin蛋白的表达及分布、Western‑Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平。本发明专利技术实现了内耳耳蜗无创给药基因转染的突破，避免了传统外科手术暴露鼓室对听觉器官的损伤，对内耳的基因转染具有一定的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法
本专利技术涉及生物医药的研究和应用，具体是一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法。
技术介绍
内耳基因转染是各种感音性听力损失机制研究和生物治疗的重要技术，但是由于内耳结构相对封闭，与全身血液循环之间存在血-迷路屏障，系统给药途径进入内耳的药物剂量极为有限，而既往内耳基因转染是通过外科手术暴露鼓室的方式，对外耳道和中耳可造成永久性损害，具有副作用大和操作困难等缺陷。目前，内耳药物载体主要包括病毒载体、纳米粒载体、蛋白质载体和原位凝胶，多种给药载体为内耳药物递送的研究带来了进步，而内耳基因载体主要是病毒载体和质粒，但迄今为止内耳基因转染仍然缺乏有效的，非侵入性递送系统，故建立一个新型的无创内耳基因转染给药系统具有极大的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺(非外科方法)鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin蛋白的表达及分布、Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平，最后通过统计学分析结果。作为本专利技术再进一步的方案，所述鼓膜穿刺鼓室给药的具体方法如下：取戊巴比妥钠对实验对象进行麻醉，麻醉完成后使用微量注射器于4℃下取药0.1ml经鼓膜穿刺注射入实验对象鼓室中，左耳注射的混合液为原位凝胶：重组病毒液＝1:9，右耳作为对照注射的混合液为原位凝胶：PBS液＝1:9。作为本专利技术再进一步的方案，所述鼓膜穿刺鼓室给药过程中需保持全程无菌操作。作为本专利技术再进一步的方案，所述免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，浸泡于4％多聚甲醛过夜，用6％稀硝酸脱钙4小时，梯度乙醇脱水，将耳蜗组织制成石蜡切片；选择CY3标记的绿色荧光蛋白抗体，DAPI染料标记细胞核显示耳蜗组织结构轮廓；用0.2％的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，干燥后加CY3标记的绿色荧光蛋白抗体室温孵育两小时，PBS液漂洗3次，用DAPI标记的羊抗兔IgG，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，干燥后铺片，封片；置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×10倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗组织内的表达及分布。作为本专利技术再进一步的方案，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2％的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，加入CY3标记的绿色荧光蛋白抗体，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，用羊抗兔IgG与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×100倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。作为本专利技术再进一步的方案，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测Prestin的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2％的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，加入CY3标记的Prestin抗体，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，用羊抗兔IgG与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×100倍)，观察Prestin在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。作为本专利技术再进一步的方案，所述Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗剥离基底膜，将各基底膜低温碾磨后加入RIPA裂解液冰上裂解20min，10000rpm、4℃、10min离心后收集上清蛋白液备用；用Wes仪进行Western-blot检测，样品处理严格按照试剂盒Wes12-230kDaMouseMasterkit和Wes12-230kDaMasterkitwithsplitBuffer的操作步骤，反应参数为：分离胶吸取200s、浓缩胶吸取15s、吸样9s、电泳25min(恒压375V)、凝胶清除230s、洗涤3次(每次150s)、封闭5min、Prestin抗体孵育30min、CY3标记羊抗兔IgG孵育30min、发光液曝光50s；实验结果显示各样品灰度值，以GAPDH为内参计算Prestin的相对灰度值表示其表达水平。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的新型无内耳耳蜗基因转染给药系统实现了内耳耳蜗无创给药基因转染的突破，避免了传统外科手术暴露鼓室对听觉器官的损伤，对内耳的基因转染具有一定的应用价值；重组Prestin-AAV-2载体外毛细胞靶向性强，能够将目的基因转染至外毛细胞，不仅可以实现Prestin基因的外毛细胞过表达，而且对外毛细胞其它基因的转染具有很好的借鉴价值。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。名词解释Prestin蛋白：是内耳外毛细胞中独特表达的跨膜马达蛋白，是耳蜗音频信号放大的分子基础，是耳蜗外毛细胞特有的重要感音功能蛋白。DoganM等利用Prestin作为早期检测外毛细胞损伤的指标，展示出Prestin蛋白是外毛细胞损伤相关研究的热点，Parham等发现血液中的Prestin浓度会随着噪声性外毛细胞损伤而上升，血液中Prestin水平可以作为噪声性听力损失的标志物。另外，Prestin蛋白在外毛细胞损伤时呈代偿性表达水平升高以弥补听力损失，Prestin蛋白不仅在感音性耳聋的发生机制中具有重要作用，而且对感音性耳聋的修复可能具有一定的潜在价值。实施例一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，以无特定病原体级健康雄性红目豚鼠为实验对象，具体步骤如下：(1)重组Prestin腺相关病毒载体构建利用NCBI中MedGen数据库中查找豚鼠Slc26a5基因(Prestin)序列(ID:XM_003469805.1)，并以此为模板设计引物序列进行PCR扩增(上游：GCCGAATTCCGATGGATCATGCTGAAG，下游：TAACTCGAGGGCCTCGGGTGTGGC)，原腺相关病毒质粒由启动子CAG调控增强绿色荧光蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺(非外科方法)鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；/n转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin蛋白的表达及分布、Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平，最后通过统计学分析结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组Prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺(非外科方法)鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；
转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin蛋白的表达及分布、Western-Blot检测耳蜗基底膜Prestin表达水平，最后通过统计学分析结果。


2.根据权利要求1所述的一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，其特征在于，所述鼓膜穿刺鼓室给药的具体方法如下：取戊巴比妥钠对实验对象进行麻醉，麻醉完成后使用微量注射器于4℃下取药0.1ml经鼓膜穿刺注射入实验对象鼓室中，左耳注射的混合液为原位凝胶：重组病毒液＝1:9，右耳作为对照注射的混合液为原位凝胶：PBS液＝1:9。


3.根据权利要求2所述的一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，其特征在于，所述鼓膜穿刺鼓室给药过程中需保持全程无菌操作。


4.根据权利要求1所述的一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，其特征在于，所述免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，浸泡于4％多聚甲醛过夜，用6％稀硝酸脱钙4小时，梯度乙醇脱水，将耳蜗组织制成石蜡切片；
选择CY3标记的绿色荧光蛋白抗体，DAPI染料标记细胞核显示耳蜗组织结构轮廓；用0.2％的TX-100打孔10分钟，PBS液漂洗3次，干燥后加CY3标记的绿色荧光蛋白抗体室温孵育两小时，PBS液漂洗3次，用DAPI标记的羊抗兔IgG，室温孵育2小时，PBS液漂洗3次，干燥后铺片，封片；置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×10倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗组织内的表达及分布。


5.根据权利要求1所述的一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，其特征在于，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军义，林寿凯，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44