本发明专利技术属于免疫检测技术、肿瘤检测领域，特别是指一种肿瘤标志物Cyfra21‑1的Simoa试剂盒及其应用。所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、Cyfra21‑1标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。本发明专利技术提供的基于Simoa平台和双抗夹心法检测人血清中Cyfra21‑1蛋白含量的Simoa试剂盒，不仅可以定性还可以定量的检测人血清中Cyfra21‑1含量；具有高灵敏度、高通量、较少样本量、自动化、花费时间短、操作简便、检测范围宽等特点。
Simoa kit of CYFRA21-1 and its application
【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒及其应用
本专利技术属于免疫检测技术、肿瘤检测领域，特别是指一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒及其应用。
技术介绍
CK19是细胞角蛋白I型酸性亚族成员之一，在许多人类组织中的都有表达。然而，CK19容易被蛋白酶降解成许多片段。Cyfra21-1是细胞角蛋白CK19在血清中相对稳定的一个可溶性片段。研究表明，血清中Cyfra21-1浓度介于1-10ng/mL，可以作为诊断NSCLC的一种方式，然而常规ELISA试剂盒的最低检测限在1-10ng/mL，这就造成了检测结果误差就大，重复性差。另有研究表明，带有NSCLC病人的血清Cyfra21-1浓度明显高于健康人。病人接受治疗后，随着病情好转，Cyfra21-1浓度会不同程度的降低。基于此，Cyfa21-1在血清中的额浓度可以作为临床医生在NSCLC中的诊断指标。而ELISA试剂盒无法实现准确检测血清中Cyfa21-1的额浓度。肿瘤标志物的发现和定量检测对癌症的早期诊断和预后评估起到了越来越重要的作用。血清Cyfra21-1与CEA一起已经被广泛用于NSCLC的诊断和预后评估。研究表明，带有NSCLC病人的血清Cyfra21-1浓度明显高于健康人。病人接受治疗后，随着病情好转，Cyfra21-1浓度会不同程度的降低。基于此，Cyfa21-1在血清中的额浓度可以作为临床医生在NSCLC中的诊断指标。目前临床上使用的Cyfra21-1检测方法主要是比色免疫分析法、化学发光免疫分析法、放射免疫分析法和电化学发光免疫分析法。其中，比色免疫分析法是最常见的一种方法。但是该方法灵敏度较低，耗时长，样本量需求大，不利于对病情的持续观察。其它三种方法可以快速、灵敏地检测出结果，但是这些方法重复性差，变异系数大。放射免疫分析法对操作人员还可能存在潜在的健康风险。Simoa是基于泊松分布原理和单分子技术发展起来的数字化超灵敏检测蛋白标志物的技术平台。该平台采用经典ELISA双抗夹心的方法，可以将带有单个待测蛋白的免疫磁珠载入到约46飞升的微孔中进行荧光成像。通过对发光的微孔进行计数，该平台可以对蛋白进行定性定量检测。Simoa是基于泊松分布原理和单分子技术发展起来的数字化超灵敏检测蛋白标志物的技术平台。该平台采用经典ELISA双抗夹心的方法，可以将带有单个待测蛋白的免疫磁珠载入到约46飞升的微孔中进行荧光成像。通过对发光的微孔进行计数，该平台可以对蛋白进行超灵敏定量检测。因此，基于Simoa技术开发一种高灵敏度、自动化程度高、快速、准确性好且适合推广的Cyfra21-1检测方法，对快速检测肿瘤标志物Cyfra21-1具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术提出一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒及其应用，以便解决现有技术中操作复杂、样本量需求大及灵敏度不足等技术问题。本专利的操作简单便捷、高通量、灵敏度高、样本量少适合用于大规模的筛查。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、Cyfra21-1标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。所述捕获抗体包被的磁珠的制备方法为：（1）将捕获抗体通过超滤管进行换液处理；（2）将2.7μm磁珠用EDC进行活化；（3）于4℃条件下，将步骤（1）处理的捕获抗体与步骤（2）活化的磁珠混合孵育2-3h；（4）经步骤（3）孵育的产物用PBST溶液洗两次后，用封闭液于37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，即获得捕获抗体包被的磁珠，于磁珠稀释液中储存。所述步骤（1）中捕获抗体为单克隆抗体M86541；超滤管使用的缓冲液是为50mmol/L吗啉乙磺酸缓冲液，pH=6.2。所述步骤（3）中捕获抗体的反应浓度为0.1-0.2mg/mL；活化的磁珠的反应浓度为1.2×109个/mL。所述步骤（4）中PBST溶液为10mmol/LPBS+1%Tween20，pH=7.4；封闭液为10mmol/LPBS+1%BSA，pH=7.4；磁珠稀释液为50mmol/LTris-HCl+10mmol/LEDTA+0.1%Tween20+1%BSA，pH=7.4。所述生物素化的检测抗体的制备方法为：将检测抗体用PBS溶液通过超滤管进行换液处理，于室温下加入NHS-Biotin或其衍生物，反应30min，得生物素化后的检测抗体，用超滤管进行纯化，即获得生物素化的检测抗体，其中检测抗体为单克隆抗体M86542。所述检测抗体与NHS-Biotin或其衍生物的反应物质的量比为1:40；PBS溶液为10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4。所述SBG溶液从原始浓度通过酶稀释液稀释到浓度为150pmol/L，其中酶稀释液为10mmol/LPBS+0.5%胎牛血清+1mmol/LMgCl2，pH=7.4；所述Cyfra21-1标准品通过样本稀释液被配制成1mL，其余标准品可以根据需要自行稀释配制；其中样本稀释液为10mmol/LPBS+5mmol/LEDTA+0.1%Tween20+2%BSA；荧光底物为试卤灵-β-半乳糖苷，荧光底物溶液的浓度为100μmol/L；所述肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒在制备癌症诊断试剂中的应用。所述肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒在检测人血清中Cyfra21-1含量中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的基于Simoa平台和双抗夹心法检测人血清中Cyfra21-1蛋白含量的Simoa试剂盒，为以单克隆抗体M86541为捕获抗体，以单克隆抗体M86542检测抗体，的一种人Cyfra21-1双抗体夹心数字化ELISA检测试剂盒，不仅可以定性还可以定量的检测人血清中Cyfra21-1含量；具有高灵敏度、高通量、较低样本量可为2μL、自动化、花费时间短、操作简便、检测范围宽等特点，由附图1可知本申请的最低检测限可达0.5pg/mL。本专利技术可以作为一种无创伤性的诊断和监测癌症（尤其是肺癌和胰腺癌）病程发展的方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术Cyfra21-1Simoa试剂盒标准曲线图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例本专利技术提供的用于检测人血清中Cyfra21-1含量的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，其特征在于：所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、Cyfra21-1标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。/n
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，其特征在于：所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、Cyfra21-1标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。
2.根据权利要求1所述的肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体包被的磁珠的制备方法为：
（1）将捕获抗体通过超滤管进行换液处理；
（2）将2.7μm磁珠用EDC进行活化；
（3）于4℃条件下，将步骤（1）处理的捕获抗体与步骤（2）活化的磁珠混合孵育2-3h；
（4）经步骤（3）孵育的产物用PBST溶液洗两次后，用封闭液于37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，即获得捕获抗体包被的磁珠，于磁珠稀释液中储存。
3.根据权利要求2所述的肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，其特征在于：所述步骤（1）中捕获抗体为单克隆抗体M86541；超滤管使用的缓冲液是为50mmol/L吗啉乙磺酸缓冲液，pH=6.2。
4.根据权利要求2所述的肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，其特征在于：所述步骤（3）中捕获抗体的反应浓度为0.1-0.2mg/mL；活化的磁珠的反应浓度为1.2×109个/mL。
5.根据权利要求2所述的肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒，其特征在于：所述步骤（4）中PBST溶液为10mmol/LPBS+1%Tween20，pH=7.4；封闭液为10mmol/LPBS+1%BSA，pH=7.4；磁珠稀释液为50mmol/LTris-HCl+10mmol/LEDTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李朝辉，张琳，杨冉，屈凌波，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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