一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测瓜类病毒的RNA‑RP RT‑PCR方法，将感染病毒的瓜类植物叶片采用PBST+2%PVP溶液或0.5%Triton X‑405 PBS溶液匀浆，提取样品病毒RNA于上清液中，以此上清液用于一步RT‑PCR扩增病毒目标片段，从而检测瓜类病毒。本发明专利技术仅需微量样品即可获得足量的RNA模板，用于对瓜类植物中的西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦及模式植物本生烟进行黄瓜绿斑驳花叶病毒（

A rapid rna-rp RT-PCR method for detection of cucurbit virus

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测瓜类病毒的RNA-RPRT-PCR方法
本专利技术属于植物检疫
，具体涉及一种快速检测瓜类病毒的RNA-RPRT-PCR方法。
技术介绍
葫芦科(Cucurbitaceae)植物包括118属825种，我国有32属154种35变种。我国气候条件适宜葫芦科作物的种植，是世界种植大国，以西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦等最为常见。葫芦科作物病毒病普遍发生，严重影响产量和品质。病毒主要有黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelonmosaicvirus，WMV）、番木瓜环斑病毒（Papayaringspotvirus，PRSV）和南瓜花叶病毒（Squashmosaicvirus，SqMV）等。病毒感染导致植株叶片出现花叶、厥叶，植株生长减缓、矮化，种子、蚜虫、农事操作、土壤或灌溉水传播病毒，条件适宜时，病毒病大面积发生，为害极其严重。由于病毒病危害较大，通过早期检测可以早期预防，这对葫芦科作物生产特别重要。目前，人们可采用电镜法、酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR、qRT-PCR、IC-RT-PCR、环介导等温扩增(LAMP)和芯片检测等方法进行病毒病的检测。ELISA和RT-PCR最为常用。RT-PCR方法的使用主要依赖于SDS法、CTAB法、TrizoL法和商品化纯化试剂盒等方法获得RNA模板，涉及苯酚、氯仿、β-巯基乙醇等有毒有害试剂的使用，操作繁琐，且污染环境，对实验者存在安全隐患。目前已有商品化产品用于植物基因组DNA的直接释放和扩增。对于植物RNA的直接释放和扩增，虽无商品化产品开发出来，但已有报道显示一些表面活性剂（例如Triton系列）在植物RNA释放方面有一定的潜力。考虑到不同植物组织因细胞壁性质、多糖和活性次级代谢物的存在情况等不同导致病毒核酸释放的难易程度及是否存在抑制因子方面各不相同，且这与病毒本身的侵染特性也有关系。因此，有必要对不同瓜类植物的不同病毒的RNA释放效率进行检测，从而筛选出一种较为有效的可用于瓜类植物病毒病RT-PCR检测的RNA释放方法（RNAreleaseprocedure,RNA-RP）。此外，ELISA方法中所用试剂含非离子表面活性剂Tween-20，它可能有助于RNA的释放，也用聚乙烯吡咯烷酮（PVP），它可以以氢键方式与多酚、萜烯或单宁类物质结合,防止样品氧化，减缓或消除这些物质带来的褐化干扰,并阻止这些物质与RNA发生作用，保证释放的RNA更为稳定，这说明ELISA方法中所用试剂在RNA释放方面有巨大的应用潜力。因此，本专利技术对Triton系列试剂及ELISA实验中所用试剂在瓜类植物病毒RNA释放效率、RT-PCR检测灵敏度及针对不同作物、不同病毒的适用性方面进行了分析，为快速检测瓜类病毒和病毒学研究提供新的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测瓜类病毒的RNA-RPRT-PCR方法，为检测瓜类病毒和辅助病毒学研究提供了新的方法，解决了上述问题。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种快速检测瓜类病毒的RNA-RPRT-PCR方法，包括以下步骤：（1）取待检测植株叶片于液氮中研磨，加入提取缓冲液进行剧烈震荡、混匀，离心，吸取上清备用；（2）设计与检测植株叶片相对应的特异性检测引物对，所述的特异性检测引物对包括以下六种：黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）特异性引物序列如下：CG-3467F：5＇-TGTTTGCTACYACTGTGCCTAC-3＇，SEQIDNO.1；CG-5294R：5＇-GCATCCTTGTGTCAACCARAG-3＇，SEQIDNO.2；黄瓜花叶病毒（CMV）特异性引物序列如下：CMV-R1-1F：5＇-GTTTTATTTACAAGAGCGTACG-3＇，SEQIDNO.3；CMV-R1-1627R：5＇-GCRGATGATATCACGTCCCA-3＇，SEQIDNO.4；小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）特异性引物序列如下：Z-7124F：5＇-ACGCAGAAGCGAGCGCTTA-3＇，SEQIDNO.5；Z-8302R：5＇-TCGCAGCGCAAATAGCCTC-3＇，SEQIDNO.6；西瓜花叶病毒（WMV）特异性引物序列如下：W-8674F：5＇-ATGCACCGCACTGAGGCAA-3＇，SEQIDNO.7；W-10047R：5＇-AGGACAACAAACATTACCGTA-3＇，SEQIDNO.8；番木瓜环斑花叶病毒（PRSV）特异性引物序列如下：P-5461-F：5＇-GTATGGYYTGCCTGTBATG-3＇，SEQIDNO.9；P-6987-R：5＇-CAAACCACRGAAGCTATRCC-3＇，SEQIDNO.10；南瓜花叶病毒（SqMV）特异性引物序列如下：S-RNA2-921F：5＇-GGTGGTATGTTGCTGGTTG-3＇，SEQIDNO.11；S-RNA2-2362R：5＇-GTTGCCTTTATGTAAGGAGAACTC-3＇，SEQIDNO.12；（3）以（1）中制备的上清液为模板，选取对应的特异性引物进行一步RT-PCR体系的配制和目标片段的扩增：2×1StepBuffer（DyePLus）10μL，PrimeScript1StepEnzymeMix0.8μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，上清液0.5μL，补水6.7μL，总体系共计20μL；50℃30min，94℃2min，94℃30sec，57℃30sec，72℃1Kb/min，运行35个循环，72℃总延伸2min；（4）取PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳检测；（5）电泳检测结果的分析方法为：出现目标条带的样品为阳性，不出现目标条带的样品为阴性。优选地：所述步骤(1)中的植株叶片包含瓜类植物中的西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦及本生烟。优选地：所述步骤(1)中的提取缓冲液为PBST+2%PVP溶液或0.5%TritonX-405PBS溶液。优选地：所述步骤(2)中CGMMV、CMV、ZYMV、WMV、PRSV和SqMV特异性引物对所对应的目标片段长度分别为1828bp、1627bp、1179bp、1374bp、1527bp、1442bp。优选地：所述步骤(1)所述的离心为7000-9000rpm，3-8min。优选地：所述步骤(1)所述的待检测植株叶片的重量与提取缓冲液的比例0.03-0.06g/1ml。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术制备RNA模板过程中不涉及苯酚、β-巯基乙醇、氯仿、异丙醇等有毒有害试剂的使用，对环境无污染，对实验操本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）取待检测植株叶片于液氮中研磨，加入提取缓冲液进行剧烈震荡、混匀，离心，吸取上清备用；/n（2）设计与检测植株叶片相对应的特异性检测引物对，所述的特异性检测引物对包括以下六种：/n黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）特异性引物序列如下：/nCG-3467F如SEQ ID NO .1所示；/nCG-5294R如SEQ ID NO .2所示；/n黄瓜花叶病毒（CMV）特异性引物序列如下：/nCMV-R1-1F如SEQ ID NO .3所示；/nCMV-R1-1627R如SEQ ID NO .4所示；/n小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）特异性引物序列如下：/nZ-7124F如SEQ ID NO .5所示；/nZ-8302R如SEQ ID NO .6所示；/n西瓜花叶病毒（WMV）特异性引物序列如下：/nW-8674F如SEQ ID NO .7所示；/nW-10047R如SEQ ID NO .8所示；/n番木瓜环斑花叶病毒（PRSV）特异性引物序列如下：/nP-5461-F如SEQ ID NO .9所示；/nP-6987-R如SEQ ID NO .10所示；/n南瓜花叶病毒（SqMV）特异性引物序列如下：/nS-RNA2-921F如SEQ ID NO .11所示；/nS-RNA2-2362R如SEQ ID NO .12所示；/n（3）以（1）中制备的上清液为模板，选取对应的特异性引物进行一步RT-PCR体系的配制和目标片段的扩增：2×1 Step Buffer（Dye PLus） 10 μL，PrimeScript 1 Step EnzymeMix 0.8 μL，上游引物（10 μM） 1 μL，下游引物（10 μM） 1 μL，上清液 0.5 μL，补水6.7 μL，总体系共计20 μL；50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 30 sec，57℃ 30 sec，72℃ 1 Kb/min，运行35个循环，72℃总延伸2 min；/n（4）取PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳检测；/n（5）电泳检测结果的分析方法为：出现目标条带的样品为阳性，不出现目标条带的样品为阴性。/n...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测瓜类病毒的RNA-RPRT-PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取待检测植株叶片于液氮中研磨，加入提取缓冲液进行剧烈震荡、混匀，离心，吸取上清备用；
（2）设计与检测植株叶片相对应的特异性检测引物对，所述的特异性检测引物对包括以下六种：
黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）特异性引物序列如下：
CG-3467F如SEQIDNO.1所示；
CG-5294R如SEQIDNO.2所示；
黄瓜花叶病毒（CMV）特异性引物序列如下：
CMV-R1-1F如SEQIDNO.3所示；
CMV-R1-1627R如SEQIDNO.4所示；
小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）特异性引物序列如下：
Z-7124F如SEQIDNO.5所示；
Z-8302R如SEQIDNO.6所示；
西瓜花叶病毒（WMV）特异性引物序列如下：
W-8674F如SEQIDNO.7所示；
W-10047R如SEQIDNO.8所示；
番木瓜环斑花叶病毒（PRSV）特异性引物序列如下：
P-5461-F如SEQIDNO.9所示；
P-6987-R如SEQIDNO.10所示；
南瓜花叶病毒（SqMV）特异性引物序列如下：
S-RNA2-921F如SEQIDNO.11所示；
S-RNA2-2362R如SEQIDNO.12所示；
（3）以（1）中制备的上清液为模板，选取对应的特异性引物进行一步RT-PCR体系的配制和目标片段的扩增：2×1StepBuffer（DyePLus）10μL，PrimeScript1StepEnzymeMix0.8μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘莉铭，古勤生，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41