春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种春兰

Application of Cymbidium mir390a in root development control

【技术实现步骤摘要】
春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种春兰非编码RNA（核糖核酸）miR390a在控制植物根系发育中的应用。
技术介绍
兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，全世界有25000多种，约占所有开花植物的10%。春兰（Cymbidiumgoeringii）属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高。但春兰从幼苗到开花所需要的时间较长，野生春兰实生苗需十年左右方可开花，人工组培苗在养护得当的情况下也需至少三年才能开花。古语云：“根深叶茂。”根系发育良好，有助于地上其他营养器官的生长发育，进而令植物提前进入生殖发育期。因此，研究基因对植物根系发育的分子机制对春兰育种、生产及应用具有重要意义。而miR390在植物生长发育方面（尤其是根系）具有重要作用，可为植物的遗传改良提供重要依据。MicroRNA390s（miR390s）是植物microRNAs中较为保守的古老家族之一，可参与多种植物生理过程，目前在其对植物生长发育方面的研究更多一些，包括植物侧生器官极性的形成、花器官形成及果实形成等。例如，油菜花的miR390参与了其早期胚胎的发育。OsmiR390前体基因的过表达可导致水稻出现顶端分生组织异常及营养阶段发育迟缓等表型缺陷。研究表明，miR390一般通过影响生长素信号来参与调控植物的生长发育过程。如，拟南芥AtmiR390能通过抑制ARF3和ARF4转录因子来延长幼年期推迟开花，从而间接调控花期。根是植物生长所不可或缺的重要器官，顶端分生组织为控制其生长的关键部位，而根的顶端分生组织主要由静止中心、近端分生组织及伸长区域所组成。研究表明，miR390对植物的根系发育具有重要作用。在拟南芥根分生组织中的短期细胞扩增区域，ARF5/MONOPTEROS通过结合miR390启动子上的AuxRE区域来直接调控其表达，进而影响根系的生长，而该过程对外源生长素有着强烈的响应。此外，拟南芥还可通过miR390/TAS3/ARF(ARF2/ARF3/ARF4)途径来调控侧根的生长发育。然而，miR390如何对春兰根系的发育产生影响，目前尚未有研究进行说明，因此，利用基因工程技术，将从春兰中克隆获得miR390a前体基因转入其它植物中，对于研究其功能具有重要意义，同时极具应用前景。
技术实现思路
本专利技术提供了一种春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用。一种春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用，所述植物miR390a的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。优选的，所述植物为春兰。具体方法为：将包含所述春兰miR390a的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。由于miRNA本身很短，只有20bp左右，而前体基因相比较稍长一些，将其连接到载体上有利于拟南芥转化的实现，优选的，所述前体基因的序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。本专利技术通过将春兰miR390a转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，经筛选培养获得T3代植株，发现过表达miR390a基因的拟南芥植株现幼苗期根系生长速度加快、真叶形成速度加快等表型，可见该基因在兰花及其它园艺植物生产、育种中将有广泛的用途。附图说明图1是春兰miR390a在春兰营养生长与生殖生长阶段各组织中的表达情况；图2是pBI121和春兰miR390a基因前体片段编码基因（MIR390a）重组载体示意图；图3是miR390a过表达载体构建过程的凝胶图谱。A.miR390a前体PCR扩增凝胶图谱；B.pBI121-MIR390a（miR390a前体）重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；C.pBI121-MIR390a（miR390a前体）重组质粒酶切验证图；图4是T3代阳性转基因拟南芥植株鉴定结果。A.3个株系的miR390a前体PCR扩增凝胶图谱（M：DL2000Marker；M1：阳性对照；M2：阴性对照；M3：空白对照）；B.3个株系的miR390a荧光定量分析结果；图5是播种至筛选培养基2周时，miR390a过表达拟南芥的表型（WT：野生型对照；35S:MIR390a转基因植株）。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1基因的功能预测本实施例所采用的材料是春兰“宋梅”营养生长时期及生殖生长时期的根、茎、叶，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。1）春兰各组织TotalSmallRNA的提取按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：将超低温冻存的春兰各组织迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至分别研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品分别加入到含有450μlBufferPE的1.5mL灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中。加入上清液1/10体积的BufferNB，Vortex振荡混匀，12,000rpm，4℃离心5钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中，加入450μL的BufferRL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1.5倍体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNASpinColumn中；12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNASpinColumn放回到2mlCollectionTube中；将600μL的80%乙醇加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；向RNASpinColumn膜中央加入50μLDNaseI反应液，室温静置15分钟；向RNASpinColumn膜中央加入350μL的BufferRWB，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将600μL的80%乙醇加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将RNASpinColumn重新安置于2mLCollectionTube上，12,000rpm离心2分钟；将RNASpinColumn安置于1.5mL的RNaseFreeCollectionTube上，在RNASpinColumn膜中央处加入30μL的RNaseFreedH2O室温静置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。吸取2μLRNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用于反转录。2）反转录与荧光定量分析根据春兰microRNA组学测序结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.春兰

【技术特征摘要】
1.春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物为春兰。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将包含所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡凤荣，刘倩，徐子涵，丁彦芬，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32