丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用制造技术

丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用特异性的PKM2激动剂，或向心肌细胞内转染修饰位点突变质粒，恢复细胞内PKM2的活性，可有效抑制心肌纤维化及心衰的发生。

Pyruvate kinase M2 mutant and its application in cardiovascular disease

【技术实现步骤摘要】
丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用。
技术介绍
心血管疾病是全球的头号死因，据统计从1990到2010年间，心血管疾病死亡率上升1/3，截至2015年，心血管疾病死亡人数占全球总死亡人数的31％。而心肌纤维化是各类心脏疾病共同的病理基础。心肌纤维化的过程就是心肌成纤维细胞增殖并且向肌成纤维细胞表型转化，其中包括胶原合成的增多及细胞外基质(ECM)中胶原异常沉积的过程，包括平滑肌肌动蛋白(a-SMA)，纤粘蛋白(Fibronectin)升高及I型胶原(CollagenI)分泌增多。光镜下常见广泛性、多灶性纤维化，伴邻近心肌纤维萎缩和肥大，常有部分心肌细胞肌浆空泡化。目前对心肌纤维化的机制并不十分明确，这也导致抗心肌纤维化药物研发进展缓慢。因此，研究心肌纤维化发生的分子机制并找到相应的干预靶点，能够为心肌纤维化的药物开发提供理论依据，对于心肌纤维化的预防和治疗具有重要意义。目前认为其肾素-血管紧张素-醛固酮系统，血流状态、心血管组织自分泌/旁分泌细胞因子、氧化应激、非编码RNA、遗传等多种因素的共同调控心肌纤维化。近年来，越来越多的证据表明，心肌细胞能量代谢参与多种心脏疾病的发生和发展。丙酮酸激酶(pyruvatekinase，PK)是糖酵解关键酶之一，在细胞能量代谢中居于中心地位。在哺乳动物中已发现四种PK亚型(PKM1,PKM2,PKR,PKL),其分布具有组织特异性。PKL主要分布于肝、肾及大肠组织中，PKR分布在红细胞中，这两种对其底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)亲和力较低；PKM1主要在成熟组织中表达，如脑组织、肌肉，对底物PEP高亲和力，且其活性不受磷酸化和变构调节；PKM2则分布较广泛，且其活性受结合模式(二聚体或四聚体)，底物浓度，氨基酸残基修饰及蛋白-蛋白相互作用等多个层面的广泛调控。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用，通过干预心肌细胞内PKM2第49和第326位半胱氨酸巯基亚硝基修饰，有效抑制心肌纤维化及心衰的发生。该方法包含利用C49/326S-PKM2质粒转染原代乳大鼠和成年小鼠心肌成纤维细胞，抑制PKM2的巯基亚硝基修饰；利用PKM2激动剂恢复原代乳大鼠和成年小鼠心肌成纤维细胞中PKM2的活性。技术方案：一种丙酮酸激酶M2突变体，其特征在于其核酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述核酸的突变质粒。上述核酸翻译的氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。上述氨基酸序列在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。上述氨基酸序列在制备诊断心肌纤维化试剂盒中的应用。上述氨基酸序列在制备筛选治疗心肌纤维化药物试剂盒中的应用。治疗心肌纤维化或心衰的药物，含有上述氨基酸序列。上述药物，还含有TEPP-46和DASA-58中的至少一种。有益效果：利用特异性的PKM2激动剂，或向心肌细胞内转染修饰位点突变质粒，恢复细胞内PKM2的活性，可有效抑制心肌纤维化及心衰的发生。附图说明图1:利用WT小鼠行假手术和TAC(主动脉缩窄)手术，构建小鼠的心肌纤维化模型。术后4周，收取两组小鼠的心肌组织，利用WesternBlot检测两组小鼠心肌组织中PKM2的蛋白表达水平。利用Biotin-Switch法检测两组小鼠心肌组织中PKM2的巯基亚硝基修饰水平*P<0.05。图2:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激12h,通过Biotin-Switch法检测两组细胞中PKM2的巯基亚硝基修饰(SNO-PKM2)程度,*P<0.05。图3:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激12h,通过吸光度法检测两组细胞中PKM2的活性，*P<0.05。图4:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激24h,通过RT-PCR法检测两组细胞中纤维化相关指标a-SMA和CollagenI的表达水平，*P<0.05，**P<0.01。图5:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激24h,通过WesternBlot法检测两组细胞中纤维化相关指标a-SMA的表达水平，***P<0.001。图6:通过转染过表达质粒的方式上调乳大鼠原代心肌成纤维细胞内的野生型PKM2和突变型C49/326S-PKM2的蛋白表达水平，通过Westernblot检测PKM2上调情况，通过Biotin-Switch方法检测PKM2的巯基亚硝基修饰情况，**P<0.01。图7：通过转染过表达质粒的方式上调乳大鼠原代心肌成纤维细胞内的野生型PKM2和C49/326S突变型PKM2的蛋白表达水平后，给以AngII刺激12小时后，通过RT-PCR检测细胞内纤维化基因a-SMA，ctgh的表达情况，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。图8：在原代乳鼠心肌成纤维细胞中预先给予PKM2激动剂TEPP-46，DASA-58或DMSO，之后给予AngII刺激12h后检测两组细胞中PKM2活性，*P<0.05，**P<0.01。图9:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中预先给予PKM2激动剂TEPP-46，DASA-58或DMSO，之后给予AngII刺激24h后检测两组细胞中纤维化相关指标a-SMA的表达情况，**P<0.05，##P<0.05，&&P<0.05。具体实施方式下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例11.RT-PCR(1)去除原代乳大鼠细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次。(2)加入1mLTrizol，吹下细胞，吸取至去RNA酶(RNAaseFree)的离心管中(细胞样品)，裂解5min。。(3)每个EP管内加入200μL的氯仿，剧烈振荡，斡旋数秒后，置于冰上裂解10min。(4)离心，4℃，12000rpm，15min，小心吸取上层清液(500μL)转移至新的EP管中。(5)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10min。(6)离心，4℃，12000rpm，15min，弃上清，加75％乙醇洗涤。(7)离心，4℃，12000rpm，5min，弃上清，风干，加入DEPC水(20～50μL)，检测RNA浓度。(8)RNA的逆转录反应体系程序如下：(9)引物设计：使用PrimerPremier5软件辅助设计引物，所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成。3.质粒转染原代心肌成纤维细胞(1)提取乳大鼠原代心肌成纤维细胞，细胞种板培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。(2)细胞融合至约75％时，弃培养液，用预热的PBS洗涤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丙酮酸激酶M2突变体，其特征在于其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种丙酮酸激酶M2突变体，其特征在于其核酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.含有权利要求1所述核酸的突变质粒。


3.权利要求1所述核酸翻译的氨基酸，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.权利要求3所示的氨基酸序列在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。


5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：季勇，罗姗姗，周苗，田佳馨，周雪纯，林喆，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32