一株丰原素高产菌株LPB-18N及其选育和应用制造技术

本发明专利技术公开了一株丰原素高产菌株LPB‑18N及其选育和应用，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCC NO.18720。本发明专利技术的一株丰原素高产菌株LPB‑18N可以有效地大量生产丰原素，而且节约了成本，提高了工业化生产和商业潜力，生产的丰原素具有抑菌谱广、不易产生耐药性、安全可降解等特点，在食品领域广泛应用，具有巨大的经济效益和开发成为新型食品防腐剂的潜力。

Breeding and application of lpb-18n, a high-yield strain of Fengyuan

【技术实现步骤摘要】
一株丰原素高产菌株LPB-18N及其选育和应用
本专利技术属于微生物
，涉及一株丰原素高产菌株LPB-18N及其选育和应用。
技术介绍
Fengycin(丰原素)是一种由解淀粉芽孢杆菌代谢产生的，由10个氨基酸和含14～18个C的β-羟基脂肪酸构成的一种非核糖体合成的抗菌环状脂肽。Fengycin作为一种新型生物源抗菌物质，已被证实具有强烈抑制丝状真菌的作用，可应用于植物病害生物防治等方面；另外fengycin具有抑菌谱广、不易产生耐药性、安全可降解等特点，在食品病原菌防治、食品加工、医药等方面具有较好的效果。作为一种次生代谢产物，由于fengycin是一种细胞内酶催化的合成过程，存在多种因素和因子的调控影响，其调控机理比较复杂。近年来，随着对RNA的深入研究，研究者发现sRNA在原核生物代谢过程、环境胁迫应答以及群体感应等生命活动中具有重要的调控作用。在细胞逆境胁迫应答过程中，sRNA通过与mRNA分子互补配对作用调控细胞生理功能，同时sRNA还可以调控转录水平来影响细胞内mRNA翻译，应对环境变化，影响细菌的生长和繁殖。随着对fengycin合成途径的认识和合成酶基因的定位、克隆和表达的成功，使用基因工程的手段改变菌株的遗传结构，阐明sRNA对fengycin合成的信号分子调控机理，从分子水平改良从而提高fengycin的产量成为可能。由于缺乏对现有的野生菌株分子水平的改造，导致fengycin产量较低，其成本较高，价格昂贵，大大限制了fengycin的工业化生产和大规模应用。>
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，本专利技术的一株丰原素高产菌株LPB-18N可以有效地大量生产丰原素，丰原素具有抑菌谱广、不易产生耐药性、安全可降解等特点，在食品领域广泛应用，具有巨大的经济效益和开发成为新型食品防腐剂的潜力。本专利技术还提供一株丰原素高产菌株LPB-18N的选育和应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述的一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCCNO.18720。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。本专利技术所述的菌株LPB-18N在促进丰原素增产中的应用。利用本专利技术所述菌株LPB-18N生产的含丰原素发酵液。本专利技术所述的含丰原素发酵液的制备方法，通过以下步骤所制成：将菌株LPB-18N接种于种子培养基，摇床振荡培养至对数生长期，获得种子液，将种子液接入发酵培养基中，摇床震荡培养，得发酵液；将发酵液4℃离心，收集上清液，4℃静置过夜，将溶液及沉淀4℃离心，收集菌体，于4℃下用甲醇充分溶解，最后将溶液4℃离心，得到的上清液即为丰原素的粗提取物。本专利技术所述的菌株LPB-18N的选育方法，包括如下步骤：采集土样，选育到一株菌株代号为LPB-18的解淀粉芽孢杆菌，保藏编号CGMCCNo.18719，保藏日期2019年10月22日，通过生物信息学分析，对菌株LPB-18转录组数据进行靶基因分析，获得一段长度为355bp与解淀粉芽孢杆菌丰原素合成酶存在碱基互补关系的非编码RNA(sRNA)片段，该片段被命名为FenSr3，核苷酸序列为SEQIDNO.1；通过DNA同源重组将重组片段与线性化载体连接，构建FenSr3基因敲除载体，通过电转化体系将基因敲除载体转化解淀粉芽孢杆菌LPB-18感受态中，构建基因敲除突变株，即为丰原素高产菌株LPB-18N。其中，所述FenSr3基因敲除载体的引物由序列为SEQIDNO.2-5所示。为了解决野生菌株丰原素fengycin产量低、无法适应工业化生产等技术问题，本专利技术还提供一种从分子水平改造解淀粉芽孢杆菌，提高fengycin产量的方法。本专利技术中构建了一种敲除FenSr3基因的重组解淀粉芽孢杆菌，通过同源重组技术被敲除解淀粉芽孢杆菌的FenSr3基因。具体的：(1)通过DNA重叠延伸构建重组片段，与线性化载体连接，构建FenSr3缺失突变，得到FenSr3基因敲除质粒；(2)通过电转化体系将该质粒转化原始解淀粉芽孢杆菌感受态中，得到fengycin高产菌株。本专利技术丰原素合成代谢调控基因FenSr3是调控和生产抗菌脂肽丰原素的关键基因，是在解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensLPB-18中克隆得到，所用菌株BacillusamyloliquefaciensLPB-18为专利技术人自行选育得到，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.18719，保藏日期2019年10月22日，该菌株BacillusamyloliquefaciensLPB-18可以将一定程度上生产fengycin，国际上被公认为解淀粉芽孢杆菌是一种食品安全菌株，在食品领域广泛应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术从一株解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensLPB-18中成功克隆到一种丰原素合成代谢基因FenSr3，该基因为一个与丰原素合成代谢相关的非编码RNA基因(FenSr3)，是一个全新的丰原素合成代谢相关基因。本专利技术利用丰原素合成代谢基因FenSr3构建的重组表达载体FenSr3基因敲除载体，通过电转化体系将该质粒转化解淀粉芽孢杆菌LPB-18感受态中，该利用基因的缺失，构建基因敲除突变株，获得丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCCNO.18720。该丰原素高产菌株LPB-18N丰原素fengycin产量高、效率高，发酵72h后发酵液中fengycin含量高达327.598mg/L，为原始野生菌株产量的1.72倍；本专利技术获得的菌株LPB-18N不仅fengycin产量高，而且节约了成本，提高了工业化生产和商业潜力。附图说明图1为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N菌体形态图(65×)；图2为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N菌落观察图；图3为敲除质粒PCR产物凝胶成像图(Lane1:DNAMaker，Lane2:单菌落PCR扩增产物)；图4为电转化单菌落PCR产物凝胶成像图(Lane1:DNAMaker，Lane1-4:单菌落PCR扩增产物)；图5为原始解淀粉芽孢杆菌LPB-18丰原素样品HPLC图谱；图6为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N丰原素样品HPLC图谱。具体实施方式以下结合附图和实施例作进一步说明。...

【技术保护点】
1.一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCC NO.18720。/n

【技术特征摘要】
1.一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCCNO.18720。


2.一种权利要求1所述的菌株LPB-18N在促进丰原素增产中的应用。


3.一种利用权利要求1所述菌株LPB-18N生产的含丰原素发酵液。


4.一种权利要求3所述的含丰原素发酵液的制备方法，其特征在于，通过以下步骤所制成：
将菌株LPB-18N接种于种子培养基，摇床振荡培养至对数生长期，获得种子液，将种子液接入发酵培养基中，摇床震荡培养，得发酵液；将发酵液4℃离心，收集上清液，4℃静置过夜，将溶液及沉淀4℃离心，收集菌体，于4℃下用甲醇充分溶解，最后将溶液4℃离心，得到的上...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢河东，周振，赵立，张淇涵，耿程欣，陈卫，王朝宇，赵希荣，王晓莉，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32