一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明专利技术所述高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌其细胞内α‑酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。本发明专利技术所述高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌能使L‑谷氨酰胺在培养基或细胞中积累，很大程度提高L‑谷氨酰胺的产量。实验表明本发明专利技术所述谷氨酸棒杆菌为L‑谷氨酰胺高产菌株，产生L‑谷氨酰胺的能力与未修饰菌株相比得到增强，能有效积累L‑谷氨酰胺，提高L‑谷氨酰胺的产量，且具有较高的转化率，为L‑谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。

Corynebacterium glutamate with high yield of L-glutamine and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，学名为2-氨基-5-羧基戊酰胺，分子式为C5H10N2O3，分子量为146。L-谷氨酰胺是人体内氮源代谢过程中不可缺少的条件性必需氨基酸，对保持肌肉新陈代谢、细胞分化和生长、组织创伤的修复、体内毒素的中和有着重要作用。L-谷氨酰胺广泛存在于自然界，例如，以游离状态含于南瓜、向日葵的幼苗中。虽然可自天然产物提取谷氨酰胺，但L-Gln的生产方法主要有化学合成法、酶促合成法和发酵法。化学合成法是以L-Glu为原料，经过多步化学反应合成L-Gln。其中研究时间最长、技术条件最成熟的合成法主要有：L-Gln甲酯法(“手性源”合成法)和肼法。化学合成法的特点是使用化学试剂直接合成，方法直接且反应速度较快，但转化率不高且产品中反应物及副产物残留是限制产品质量和使用范围。酶促合成法生产L-Gln是以NH4+及谷氨酸作原料，经L-Gln合成酶(GS)催化而成。与化学合成法相比，酶促合成法反应步骤相对简单，其中三磷酸腺苷(ATP)是必需的。但ATP价格昂贵，同时酶促反应底物NH4+、副产品二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制L-Gln的生成，因此该生产方法不能满足大规模工业化生产的需要。发酵法是目前最常用的L-Gln生产方法，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为生产菌发酵生产L-Gln。谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性，作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产L-氨基酸、核苷酸及其他有机酸。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前L-Gln的菌种的发酵性能仍较差、L-Gln的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。α-酮戊二酸脱氢酶复合体(ODHC)能够催化α-酮戊二酸向琥珀酰辅酶A的转化，是谷氨酸合成代谢的主要竞争途径。本专利技术对ODHC的Elo亚基的编码基因odhA进行失活改造可以使棒杆菌在细胞内积累大量谷氨酸。敲除yggB基因使谷氨酸外运蛋白(YggB)蛋白失活，使谷氨酸无法分泌到胞外从而使谷氨酸在胞内大量积累。谷氨酰胺合成酶(GS)是谷氨酰胺合成的关键基因，可以被腺苷酰化修饰。腺苷化修饰就是AMP以共价键方式与肽链上的酪氨酸残基结合产生GS(AMP)的过程，腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失。本专利技术通过解除对GS的腺苷酰化修饰作用可以很大程度提高L-谷氨酰胺的产量。在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失，命名为MHZ-0512-1。在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内谷氨酸外运蛋白活性丧失，命名为MHZ-0512-2。在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失，且编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失，且所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除，命名为MHZ-0512-3。在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失，且编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内谷氨酸外运蛋白活性丧失，且所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除，命名为MHZ-0512-4。在本专利技术另一些实施方案中，本专利技术所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失、编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失，且编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和谷氨酸外运蛋白活性均丧失，同时所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除，命名为MHZ-0512-5。进一步的，在一些实施例中，所述odhA基因片段缺失为odhA基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除。在一些实施例中，所述yggB基因片段缺失为yggB基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除。本专利技术所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌均可采用同源重组的方法进行基因改造获得。本专利技术还提供了所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌的构建方法，制备odhA基因片段缺失重组载体、yggB基因片段缺失重组载体和glnAY405F点突变重组载体，将odhA基因片段缺失重组载体和/或yggB基因片段缺失重组载体以及glnAY405F点突变重组载体转化谷氨酸棒杆菌获得高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌。本专利技术中，所述载体为pK18mobsacB载体。本专利技术中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株。该菌株没有生产L-谷氨酰胺的能力，且没有对L-谷氨酰胺代谢流路相关基因进行定向修饰。本专利技术中，所述制备odhA基因片段缺失重组载体的方法具体为以A1/A2、A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增odhA碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组A1/A4进行overlapPCR扩增得到odhA基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔodhA重组质粒。本专利技术中，所述制备yggB基因片段缺失重组载体的方法具体为以B1/B2、B3/B4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增yggB碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组B1/B4进行overlapPCR扩增得到yggB基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔyggB重组质粒。本专利技术中，所述制备glnAY405F点突变重组载体的方法具体为以C1/C2、C3/C4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增glnA基因点突变的上、下游片段，利用引物组C1/C4进行overlapPCR扩增得到glnA基因点突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-glnAY405F重组质粒。其中，所述A1的序列如SEQIDNo.1所示；所述A2的序列如SEQIDNo.2所示；所述A3的序列如SEQIDNo.3所示；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。


2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失为编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失；所述谷氨酸外运蛋白活性丧失为编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失；所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除为编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。


3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述odhA基因片段缺失为odhA基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除；所述yggB基因片段缺失为yggB基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除。


4.权利要求1-3任一项所述的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，制备odhA基因片段缺失重组载体、yggB基因片段缺失重组载体和glnAY405F点突变重组载体，将odhA基因片段缺失重组载体和/或yggB基因片段缺失重组载体以及glnAY405F点突变重组载体转化谷氨酸棒杆菌获得高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌。


5.根据权利要求4所述的构建方法，所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13032菌株；所述载体为pK18mobsacB。


6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述制备odhA基因片段缺失重组载体的方法具体为以A1/A2、A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增odhA碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组A1/A4进行overlapPCR扩增得到odhA基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔodhA重组质粒；
所述制备yggB基因片段缺失重组载体的方法具体为以B1/B2、B3/B4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板扩增yggB碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组B1/B4进行overlapPCR扩增得到yggB基因片段缺失产物，与pK18...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成，胡丹，吴涛，
申请(专利权)人：新疆梅花氨基酸有限责任公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65