一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用，该葡萄汁酵母菌株可以降低双乙酰的含量，联合过表达羟酸还原异构酶，或者部分敲除α‑乙酰乳酸合成酶编码基因ILV2后，可以进一步降低双乙酰的含量，并且降低高级醇的含量。利用该菌株发酵提高了葡萄酒的风味质量，可酿造出风味优良且更有利于健康的葡萄酒。

A strain of Saccharomyces cerevisiae overexpressing dihydroxyisovalerate dehydratase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用
：本专利技术属于生物工程和基因工程
，涉及工业微生物的育种及其应用，具体是涉及一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其在制备葡萄酒中的应用。
技术介绍
：葡萄酒是世界上最古老的具有浓厚文化底蕴的绿色保健饮料，也是现代生活中不可或缺的饮品。葡萄酒中的香气成分复杂多样，相对含量从每升几纳克到几百毫克不等，在葡萄酒的呈香过程中起到重要作用。双乙酰，又称2,3-丁二酮，是葡萄酒发酵过程中的重要副产物，葡萄酒中双乙酰的含量超过阈值就会产生令人不快的馊饭味，严重破坏葡萄酒的风味，并影响葡萄酒的感官质量。因此，葡萄酒中的双乙酰含量必须控制在合适的范围内。目前对于双乙酰调控的研究主要集中在啤酒发酵过程中。刘光诚等人专利技术了七日酿酒法，即在糖化和发酵过程中加入具有超强的电子还原性和离子交换功能的陨水速成剂，大幅降低了双乙酰指标，改善啤酒的品质(中国专利，CN107619733A，2018-01-23)。赵云财等人制作一种富含α-氨基氮的啤酒专用麦芽糖浆，并用该麦芽糖浆作辅料生产啤酒，可以大幅度降低双乙酰含量，提高啤酒的非生物稳定性(中国专利，CN103571672A，2014-02-12)。李红等人采用含有适当浓度D-缬氨酸的13°P麦汁在适当条件下驯化酵母，从酵母泥中筛选出对D-Val敏感的菌株并进行发酵实验，检测敏感菌株双乙酰含量，其降低率可达到34.08％(中国专利，CN104877922A，2015-09-02)。但上述工艺和菌株主要用于啤酒上，并未将其应用于葡萄酒，而且菌株通过筛选突变而来，重复性差。二羟异戊酸脱水酶编码基因ILV3是将高级醇的氨基酸分解代谢途径(Ehrlich途径)和糖代谢合成途径(Harris途径)相关基因，目前对它的研究主要集中在该基因对高级醇的影响，例如，有学者认为二羟异戊酸脱水酶会增加高级醇中异丁醇的含量，可以通过敲除ILV3基因而降低异丁醇的含量(过量表达酿酒酵母ZWF1基因对异丁醇产量的影响，李敬知等，中国科技论文，第12卷，第6期，2017年3月)。然而这些基因对双乙酰的影响未见报道。在酿酒过程中酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是传统普遍应用的酵母菌种，但研究发现，在现代葡萄酒发酵中的非酿酒酵母数量较高(每毫升106-108个细胞数量)且持续存在，其与酿酒酵母一样在产生酒精的同时对葡萄酒的风味和香气等感官特征有着重要的影响，这导致人们又重新看待这些酵母在酿酒中的作用。随着分子生物学技术的发展，利用基因工程改造非酿酒酵母获得具有新的理想特征的各种酵母菌种，酿造具有复杂口感、风格独特的葡萄酒将会成为现代葡萄酒产业发展的重要方向。
技术实现思路
：本申请发现，葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)是一种具有潜在的酿酒特性的非酿酒酵母，其在高产甘油和低产乙醇的同时，也能比酿酒酵母产生更多的芳香物质。利用分子育种技术构建调控双乙酰的过表达二羟异戊酸脱水酶葡萄汁酵母工业菌株，对提高葡萄酒的风味质量具有重要意义。因此，本专利技术的第一方面，提供一种低产双乙酰的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶。优选的，所述菌株还部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，优选的，所述菌株还低产高级醇。更优选的，所述菌株还过表达羟酸还原异构酶。更优选的，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶和部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，或者，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶和羟酸还原异构酶。更优选的，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶、羟酸还原异构酶和部分敲除编码的α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。优选的，所述ILV2基因部分敲除为至少敲除一个等位基因，例如，敲除一个等位基因，敲除两个等位基因，敲除三个等位基因。所述低产双乙酰和高级醇葡萄汁酵母是在出发葡萄汁酵母菌株中部分敲除编码α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，同时过表达分别由ILV3和ILV5编码的二羟异戊酸脱水酶和羟酸还原异构酶所得。所述ILV2基因其GeneID为：855135，核苷酸序列如表中SEQNO:1所示；所述ILV3基因其GeneID为：853473，核苷酸序列如表中SEQNO:2所示；所述ILV5基因其GeneID为：851069，核苷酸序列如表中SEQNO:3所示。所述启动子PGK1其GeneID为：850370，核苷酸序列如表中SEQIDNO:4所示。优选的，所述出发酵母菌株为葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)CICC1465。本专利技术还提供一种低产双乙酰的葡萄汁酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：1)过表达ILV3的重组菌株的构建；优选的，构建ILV3基因多拷贝表达载体构建过表达ILV3的重组菌株；或者，所述构建方法还包括，2)ILV2基因的部分敲除菌株的构建；优选的，采用多重基因中断技术阻碍α-乙酰乳酸合成酶的表达构建ILV2基因的部分敲除菌株；和/或，3)过表达ILV5的重组菌株的构建；优选的，构建ILV5基因多拷贝表达载体构建过表达ILV5的重组菌株。更优选的，所述构建方法包括：1)：将基因ILV3和/或ILV5通过同源重组原理分别整合至质粒上构建获得携带基因ILV3、ILV5、或者，ILV3和ILV5的重组质粒；2)：ILV2基因的部分敲除菌株的构建：采用缩进式的引物设计方法，PCR扩增筛选标记基因，结合多重基因中断技术将标记基因整合至ILV2的等位基因，且应用Cre重组酶去除，构建部分敲除ILV2等位基因的菌株，优选的，所述部分敲除ILV2等位基因包括敲除一个、两个或者三个ILV2等位基因；3)：通过醋酸锂转化法将步骤1)的重组质粒分别导入出发菌株得到过表达ILV3基因的重组菌株、过表达ILV5基因的重组菌株，或者，同时过表达ILV3和ILV5基因的重组菌株；4)：将步骤1)的重组质粒分别导入步骤2)中敲除ILV2等位基因的菌株中，得到部分敲除ILV2基因且过表达ILV3基因的重组菌株、部分敲除ILV2基因且过表达ILV5基因的重组菌株和部分敲除ILV2基因且同时过表达ILV3和ILV5基因的重组菌株。更优选的，所述构建方法包括：1)：将启动子基因PGK1连接于质粒Yep352的BamHI和SalI酶切位点处，构建质粒Yep-P，将基因片段ILV3和ILV5通过同源重组原理分别整合至质粒Yep-P上基因PGK1的XhoI位点构建质粒Yep-P3和Yep-P5，将质粒Yep-P3上的PGKp-ILV3-PGKt基因片段和质粒Yep-P5分别通过SmaI酶切而连接构建质粒Yep-P35，将基因片段KanMX通过同源重组原理分别整合至质粒Yep-P3、Yep-P5和Yep-P35的ApaI位点构建重组质粒Yep-KP3、Yep-KP5和Yep-KP35；2)：采用缩进式的引物设计方法，以质粒pUC6为模板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低产双乙酰的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株，其特征在于，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种低产双乙酰的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株，其特征在于，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶。


2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株中ILV2基因部分敲除，优选的，所述部分敲除为至少敲除一个等位基因。


3.如权利要求1-2任一所述的菌株，其特征在于，所述菌株还过表达羟酸还原异构酶。


4.如权利要求1-3任一所述的菌株，其特征在于，所述菌株过表达二羟异戊酸脱水酶、羟酸还原异构酶和部分敲除编码的α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因。


5.一种低产双乙酰的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
1)过表达ILV3的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，李凭，李彤，肖冬光，于爱群，郭学武，陈叶福，董健，林良才，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12