用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片及方法技术

本发明专利技术提供一种用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片及方法，包括进样口、出样口和反应室；所述反应室内设有微柱阵列和微渠道，微柱之间的间距小于细胞的尺寸。微渠道包括连通反应室入口和微柱阵列的若干个第一微渠道、连通反应室出口和微柱阵列的若干个第二微渠道，以及微柱之间的间隙构成的连通第一微渠道和第二微渠道的第三微渠道。本发明专利技术将细胞富集、清洗、核酸杂交实验整合在一个芯片装置内，以解决传统荧光杂交实验所需时间长、操作复杂、多步操作等带来的污染问题。杂交实验结束后，可以直接用显微镜进行原位的荧光观测表征。

Chips and methods for cell filtration, immobilization and in situ fluorescent nucleic acid hybridization

【技术实现步骤摘要】
用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片及方法
本专利技术属于细胞分析芯片
，具体涉及一种可应用稀有细胞固定和过滤并原位进行荧光核酸杂交实验的微流控芯片及方法。
技术介绍
单细胞基因分析是一种将群体中的细胞隔离并对单独细胞内的核酸等信息进行检测分析的技术。该技术避免了因对整个群体分析而导致遗漏掉少量但关键的细胞分子生物学信息。它能反应单独个体的细胞间的差异，极大的增强了我们对细胞异质性的认识，因此被认为是应用于癌症和其它领域分析的非常有潜力的新技术手段。基于核酸分子杂交技术，使已知序列的核酸分子片段标记上可检测的荧光信号，可用来检测细胞样品中未知的核酸序列，从而将具有异质性细胞从群体细胞中识别出来，帮助进行下游分析。另一方面，通过筛选技术处理后的临床细胞样本量很低，单位体积溶液内的细胞数目较少，通常需要对细胞进行富集才能进行后续实验，而这也需要额外的设备和操作时间。传统的荧光核酸原位杂交实验涉及到前期细胞处理，中期样片制备和后期结果表征等多个步骤。在该步骤一系列操作过程中由于样品的转移极易导致杂质污染，因此，一体化的实验装置对于提高实验成功率及其重要。目前还没有一种简单易行的方法可以实现细胞的过滤、富集、原位荧光杂交实验表征。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种芯片，将细胞富集、清洗、核酸杂交实验整合在一个芯片装置内，以解决传统荧光杂交实验所需时间长、操作复杂、多步操作等带来的污染问题。杂交实验结束后，可以直接用显微镜进行原位的荧光观测表征。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片，包括进样口、出样口和反应室；其特征在于，所述反应室内设有微柱阵列，微柱之间的间距小于细胞的尺寸。优选的，所述反应室还包括微渠道，所述微渠道包括连通反应室入口和微柱阵列的若干个第一微渠道、连通反应室出口和微柱阵列的若干个第二微渠道，以及微柱之间的间隙构成的连通第一微渠道和第二微渠道的第三微渠道。微柱之间横向和纵向的渠道尺寸相同。第三渠道的作用是固定细胞和方便液滴流动。第一渠道和第二渠道的作用是方便流体从进样口均匀的流向阵列，和从阵列流出并均匀的流向出样口。这样才能保证液体在阵列内流速一致。使得最终在阵列内所固定的细胞所处的液体环境一致。优选的，所述芯片装置水平放置时，出样口、第二微渠道、第三微渠道的高度依次增加，第三微渠道与第一微渠道的高度相等。优选的，所述微柱之间的间距为5-14um。优选的，其特征在于，所述微柱包括上下两部分，上部分为圆台，下部分为立方体，圆台的上表面半径为4-15um，下表面半径为8-18um，立方体的长度为15-30um，高度为4-30um。优选的，所述芯片装置的两侧设有滑轨，滑轨中嵌有封闭盖，封闭盖可封闭芯片。基于上述芯片的原位进行细胞荧光核酸杂交实验的方法，包括如下步骤：步骤1：清洗所述芯片；步骤2：在微柱阵列上方，以每1-10s的时间间隔，逐滴滴入细胞分散液；步骤3：从出样口连接注射泵，不断的将流入的液体吸出；步骤4：从进样口加入细胞清洗液，清洗5-10分钟；步骤5：进样口加入杂交反应液；步骤6：关闭出样口注射泵；步骤7：封闭整个芯片，进行核酸杂交实验和荧光表征。有益效果：(1)传统的核酸荧光杂交实验需要进行细胞处理、杂交实验和表征多步操作，涉及到多种试剂。本专利技术集合多操作于一体，避免多步操作引入的杂质污染，试剂的使用量小，成本低。(2)芯片装置体积小，便于存储和携带，自带封盖封闭，避免杂交实验时试剂的挥发和杂质污染。通过外部设备，芯片可以方便的进行温度和湿度的控制。(3)简单操作，无需复杂专业背景。(4)可配合上下游分析检测设备，芯片阵列结构自带过滤效果，可以将含有少量细胞的大体积溶液过滤，可以将细胞富集，避免杂交前还得进行细胞富集的复杂操作。杂交实验结束后，芯片样片可以直接移动，方便的直接进行下游的荧光表征，无需其他操作。(5)适合各种尺寸均匀的细胞，可以根据实际样品中细胞的大小来设计修改阵列尺寸，使其具有广谱适用性。(6)本专利技术将多操作集中，减少了整个过程的处理时间和步骤，将检测周期缩短，可控性强。附图说明图1为芯片装置总览图，A为出样口；B为微柱阵列；C进样口；D微渠道；E封闭盖。图2为芯片装置侧面图。图3为芯片正面透视图。A为出样口；C为进样口；D1为第一微渠道；D2为第二微渠道；D3为第三微渠道。图4为微柱阵列结构图。图5为微柱阵列中的单个微柱示意图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。如图1所示，本专利技术设计了一个基于透明塑料或玻璃材质的微流控芯片，该芯片包括：进样口、导流渠道、细胞阵列室、出样口和封闭盖。1)进样口和出样口主要进行液体样品(包括细胞清洗液和反应试剂)流入和流出。2)导流渠道设计多通道，负责将进样口进入的流体连通到阵列室和将阵列室流出的液体导流到出样口。微渠道包括连通反应室入口和微柱阵列的若干个第一微渠道、连通反应室出口和微柱阵列的若干个第二微渠道，以及微柱之间的间隙构成的连通第一微渠道和第二微渠道的第三微渠道。3)细胞阵列室由微柱阵列和微渠道组成，微阵列用于细胞的固定、过滤，微渠道用于液体的流通，方便细胞清洗和提供反应试剂。4)封闭盖用于封闭整个反应体系，避免了高温核酸杂交反应时液体的大量蒸发。如图2所示，封闭盖E可以滑动，进行细胞操作实验时可以将滑盖打开；进行荧光杂交实验时将滑盖关闭，实现封闭整个反应室。如图3所示，出样口A、进样口C、第一微渠道D1、第二微渠道D2、第三微渠道D3的底部高度之间的关系为：A<D2<D3＝D1，左低右高的设计可以方便流体在自然重力的条件下流动，避免出现回流。如图4所示，第三微渠道D3宽度是5-14um。距离的设计与具体要操作的细胞有关，可以根据实验样品细胞的尺寸进行修改。如图5所示，半径R1是4-15um，半径R2是8-18um，长度L是15-30um，高度H是4-30um。以聚二甲基硅氧烷为材质的芯片为例，细胞实验方法包括如下步骤：1)取干净芯片，取下封闭盖；2)将芯片放入等离子清洗仪处理2分钟；3)处理后的芯片，在微柱阵列上方，以每1-10s的时间间隔，逐滴滴入细胞分散液；4)从出样口连接注射泵，不断的将流入的液体吸出；5)全部滴完细胞液后，从进样口加入细胞清洗液，清洗5-10分钟；6)进样口加入杂交反应液；7)5分钟后，关闭出样口注射泵；8)封盖封闭整个芯片，进行核酸杂交实验和荧光表征。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出：对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片，包括进样口、出样口和反应室；其特征在于，所述反应室内设有微柱阵列，微柱之间的间距小于细胞的尺寸。/n

【技术特征摘要】
1.用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片，包括进样口、出样口和反应室；其特征在于，所述反应室内设有微柱阵列，微柱之间的间距小于细胞的尺寸。


2.根据权利要求1所述的用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片，其特征在于，所述反应室还包括微渠道，所述微渠道包括连通反应室入口和微柱阵列的若干个第一微渠道、连通反应室出口和微柱阵列的若干个第二微渠道，以及微柱之间的间隙构成的连通第一微渠道和第二微渠道的第三微渠道。


3.根据权利要求2所述的用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片，其特征在于，所述芯片装置水平放置时，出样口、第二微渠道、第三微渠道的高度依次增加，第三微渠道与第一微渠道的高度相等。


4.根据权利要求1所述的用于细胞过滤、固定并原位进行荧光核酸杂交实验的芯片，其特征在于，所述微柱之间的间距为5-14um。


5.根据权利要求1所述的用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦玉岭，吴丽，刘金霞，冀海伟，周晓波，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32