莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。本发明专利技术中发现莪术醇可直接与NQO2蛋白结合，抑制NQO2酶活，且发现NQO2蛋白的第126位、128位、161位或178位氨基酸突变丙氨酸后，NQO2与莪术醇不再结合且NQO2酶活性受到影响。因此，莪术醇可作为NQO2蛋白抑制剂，用于解决NQO2高表达所引起的肿瘤药物耐受方面的治疗。另外，本发明专利技术还提供了一种NQO2蛋白突变体，为NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸突变丙氨酸，为后续NQO2蛋白抑制剂或抗肿瘤药物方面的研究提供有效途径。

The application of Curcumol in the preparation of NQO2 protein inhibitor

【技术实现步骤摘要】
莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用
本专利技术属于医药
，特别涉及莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。
技术介绍
莪术醇(Curcumol)是莪术提取物中主要的活性成分之一[1]，其结构式如式I所示：早先有相关报道莪术醇具有抑制肿瘤血管生成、诱导细胞凋亡、抗病毒、抗血栓、抗菌等功效[1]。在肿瘤相关的研究领域中，高浓度莪术醇对乳腺癌[2]、结直肠癌[3]、胃癌[4]、肝癌[5]、肺癌[6]等都有一定的抑制效果。但到目前为止，尚未有莪术醇靶标蛋白的相关报道。醌氧化还原酶2(NQO2)可以利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，将醌还原为氢醌，NQO2常被认为具有代谢还原与解毒的作用[7]，当NQO2与一些特定的小分子抑制剂相相结合时会导致ROS产生[8,9]。在肿瘤研究中已有报道指出NQO2在肝癌和肾癌中高表达，在我们的前期研究中发现，NQO2在肺腺癌病人癌组织中高表达，高表达NQO2的病人生存预后差。因此，开发在体内外均能发挥效应的NQO2蛋白的抑制剂，是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种NQO2蛋白突变体。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：莪术醇在制备NQO2(醌氧化还原酶2)蛋白抑制剂中的应用。所述的莪术醇通过结合到NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸位点上，实现抑制NQO2蛋白表达的目的。所述的NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述NQO2蛋白的基因序列如SEQIDNO.2所示。所述的莪术醇的使用浓度为100～200μM。莪术醇作为NQO2蛋白抑制剂的应用(所述的应用为非疾病治疗目的，如体外环境下进行应用)。所述的NQO2蛋白抑制剂包括治疗有效量的莪术醇和药学上可接受的载体。所述NQO2蛋白抑制剂可制成各种形式的口服或注射制剂，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、缓控释制剂、口服液、合剂、糖浆剂、液体注射剂、注射用粉剂和注射用片剂等。一种NQO2蛋白突变体，为NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸突变丙氨酸(即NQO2蛋白的第126位苯丙氨酸突变为丙氨酸，NQO2蛋白的第128位异亮氨酸突变为丙氨酸，NQO2蛋白的第161位天冬氨酸突变为丙氨酸，NQO2蛋白的第178位苯丙氨酸突变为丙氨酸)；其中，NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种NQO2蛋白突变体的基因，其编码上述NQO2蛋白突变体。一种重组表达载体，含有所述的NQO2蛋白突变体的基因。所述的重组表达载体为重组pGEX-4T-1。一种重组宿主细胞，含有所述的重组表达载体。所述的重组宿主细胞为重组大肠杆菌；优选为重组大肠杆菌BL-21。所述的NQO2蛋白突变体在筛选或制备NQO2蛋白抑制剂和/或抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤包括肺癌等；优选为肺腺癌。一种筛选NQO2蛋白抑制剂和/或抗肿瘤药物的方法，包括使用上述NQO2蛋白突变体的步骤。本专利技术的技术原理：选取肺腺癌细胞株A549与H1299，采用蛋白热稳定(CETSA)、等温量效反应(ITDRECETSA)、荧光滴定实验、表面等离子共振(SPR)及分子对接来确定莪术醇与NQO2是否结合；通过体内与体外NQO2酶活性检测实验，证明莪术醇对NQO2功能的影响情况。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)NQO2蛋白在肺腺癌中高表达，可能与临床化疗耐受有关，本专利技术中发现莪术醇可直接与NQO2蛋白结合，抑制NQO2酶活；且发现了氨基酸F126、I128、N161以及F178位点是莪术醇与NQO2的结合的关键位点，分别突变上述位点，NQO2与莪术醇不再结合且NQO2酶活性受到影响。因此，莪术醇可作为NQO2抑制剂，可用于解决NQO2高表达所引起的肿瘤药物耐受的治疗。(2)本专利技术利用天然中药提取物莪术醇作为NQO2蛋白的抑制剂，进而达到解决肿瘤药物耐受的问题。本专利技术主要具备如下优点：①莪术醇直接作用于NQO2蛋白抑制该蛋白活性，且相互作用位点已经研究清楚；②莪术醇存在于传统中草药中，提取制备方便，安全性高，价格低廉，开发利用的前景好。附图说明图1是免疫组织化学方法检测NQO2在肺腺癌组织样品中的表达情况图；其中，A为NQO2在肺腺癌组织中染色强度的评分标准；B与C代表性图片显示NQO2在肺腺癌病人癌旁与癌组织中的表达强度及统计；D为NQO2在肺腺癌不同分期中的表达强度统计；E为KM法生存分析NQO2在肺腺癌病人中的预后潜力。图2是热稳定实验验证莪术醇与NQO2蛋白结合情况图；其中，A为CETSA实验验证NQO2蛋白在莪术醇处理下蛋白热稳定性变化情况；B为ITDRECETSA实验验证在温度为67℃情况下不同浓度莪术醇处理下NQO2稳定性变化情况。图3是荧光滴定实验表明莪术醇与NQO2之间存在直接相互作用图；其中，A为滴定荧光淬灭曲线；B荧光淬灭程度累积曲线。图4是SPR实验表明莪术醇与NQO2之间存在直接相互作用图；其中，A为SPR曲线；B为SPR信号累积曲线。图5是NQO2酶活性分析图；其中，A为人肺腺癌细胞A549；B为人肺腺癌细胞H1299。图6是分子对接模拟莪术醇与NQO2结合模式图；其中，A分子对接示意图；B莪术醇与NQO2结合位点预测。图7是NQO2各重组蛋白的纯化效果与荧光滴定曲线图；其中，A为NQO2各重组蛋白的纯化效果图；B为荧光滴定曲线。图8是不同突变形式NQO2酶活性分析图；其中，A体外重组蛋白水平；B细胞水平。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。除非特别说明，本专利技术采用的方法和设备为本
常规方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本专利技术所用试剂和原材料均可通过市售获得。本专利技术中涉及到NQO2(HomosapiensN-ribosyldihydronicotinamide:quinonereductase2)蛋白序列如SEQIDNO.1所示，编码NQO2蛋白的基因序列(NCBIReferenceSequence:NM_001290221.1)如SEQIDNO.3所示：NQO2蛋白序列(SEQIDNO.1)NQO2基因序列(SEQIDNO.2)GCAGGTAAGAAAGTACTCATTGTCTATGCACACCAGGAACCCAAGTCTTTCAACGGATCCTTGAAGAATGTGGCTGTAGATGAACTGAGCAGGCAGGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。


2.根据权利要求1所述的莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：
所述的莪术醇通过结合到NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸上，实现抑制NQO2蛋白表达的目的；
所述的NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求2所述的莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：
编码所述NQO2蛋白的基因序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求1所述的莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：
所述的莪术醇的使用浓度为100～200μM。


5.莪术醇作...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆瑜，张静，汪洋，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44