本发明专利技术提供一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株F2，其保藏编号为CGMCC No.17258。本发明专利技术还提供含有所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液的应用。本发明专利技术的F2菌株在18h能够将25mg/L的亚硝酸盐降解到0mg/L，具有优异的亚硝酸盐降解能力。将筛选到的施氏假单胞菌和腐殖酸配合使用，可以进一步显著提高水体中氨氮、亚硝酸盐的转化效率提升。本发明专利技术中施氏假单胞菌和腐殖酸都水产养殖中常用的非药品制剂，具有安全、生态的特点。
Fermentation liquid and application of a strain F2 of Pseudomonas schneideri
【技术实现步骤摘要】
一株施氏假单胞菌菌株F2，其发酵液及应用
本专利技术涉及一株施氏假单胞菌及其应用。
技术介绍
水产养殖过程由于高蛋白饲料和肥水产品的过渡使用，再加上水生动物以氨氮形式进行排泄，这几个方面造成了水体中氨氮、亚硝酸盐的含量过高，严重影响了水生动物的健康，给养殖造成很大的损失。氨氮、亚硝酸盐对水生动物的影响主要包含以下几个方面：降低水产动物机体内的供氧能力；干扰细胞内外的K+浓度使之失衡,从而破坏神经系统传输、骨骼肌收缩等功能，使水产动物活力下降；抑制免疫系统功能,降低水产动物对病原生物的抵抗力。氨氮、亚硝酸盐浓度超标严重降低了水产养殖的成功率。目前去除水中的氨氮、亚硝酸常用的方法有物理法、化学法和生物法。物理方法主要使用物理吸附，比如凹凸棒石、沸石粉等，物理方法仅是把水体中的氨氮、亚硝酸盐吸附在固体表面，并没有从根本上减少水体中氨氮、亚硝酸的总量，在温度、pH发生变化时，又会发生解吸附现象，水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度又会重新升高。化学方法去除氨氮、亚硝酸主要有离子交换、折点加氯等。离子交换需要将废水收集，通过离子交换树脂，将氨氮、亚硝酸离子进行置换，这种方法生产成本高、工艺复杂，仅适用于工业化养殖场所，使用推广范围有限。折点加氯需要使用到氯气，操作安全性上有很大风险，另外氯气在水体与水反应生产次氯酸对鱼虾等养殖动物危害性更大。因而化学方法在使用上存在成本高、范围小、安全性低等特点。生物法主要是利用硝化细菌和反硝化细菌将氨氮、亚硝酸通过硝化和反硝化作用转化成氮气，因反应条件温和、又能减少水体中总氮含量，因而是最为安全有效的方法。目前生物法使用的硝化细菌和反硝化细菌存在生长速度慢、反应时间长、处理效率低的特点。因而，亟需筛选更加安全有效的微生物菌种来转化水体中氨氮、亚硝酸含量。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)菌株F2，其保藏编号为CGMCCNo.17258。本专利技术的施氏假单胞菌F2菌株，分离自养殖水域的水样和泥样，具有显著的亚硝酸盐降解能力。利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16SrRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQIDNo.2)和下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQIDNo.3)扩增细菌16srRNA基因片段。经过测序得到该菌属于施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)，序列如SEQIDNo.1所示。将筛选到的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)命名为F2，于2019年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.17258。本专利技术还提供一种施氏假单胞菌菌株F2的发酵液。其中，所述发酵液中，施氏假单胞菌菌株F2的活菌数为1.0×108～109cfu/mL。在本专利技术一个优选的实施方案中，所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液中添加腐殖酸和/或其盐，混合制成复合液体微生态制剂。其中，所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液与所述的腐殖酸和/或其盐的体积质量比(ml:g)为2:1-2。本专利技术还提供所述的施氏假单胞菌菌株F2和/或所述的发酵液在降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐中的应用。本专利技术还提供一种降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的方法，其为每亩使用所述的施氏假单胞菌菌株F2发酵液1000-2000mL，并配合使用500-1000g腐殖酸钠，每5-7天使用一次。本专利技术还提供所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵方法，所用的液体发酵培养基组成为：蛋白胨8-15g/L，葡萄糖15-25g/L，乳糖0.1-0.5g/L，酵母粉1-5g/L，氯化钠1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，玉米浆粉0.1-0.5g/L；发酵条件：温度30-37℃，搅拌速率80-150rpm，通气比：1:0.2-0.5，培养时间20-24h，培养密度为1.0×108～109cfu/mL。本专利技术的F2菌株在18h能够将25mg/L的亚硝酸盐降解到0mg/L，具有优异的亚硝酸盐降解能力。将筛选到的施氏假单胞菌和腐殖酸配合使用，可以进一步显著降低养殖水体中氨氮和亚硝酸的含量，并提高养殖动物的生长性能。本专利技术中施氏假单胞菌和腐殖酸都水产养殖中常用的非药品制剂，具有安全、生态的特点。附图说明图1所示为亚硝酸钠标准曲线图。图2所示为不同菌株亚硝酸盐降解能力比较。图3所示为施氏假单胞菌F2菌落照片。图4所示为施氏假单胞菌F2显微镜下照片。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1亚硝酸盐的测定方法建立(1)实验试剂：格利斯Ⅰ、格利斯Ⅱ、标准浓度的硝酸钠2.5mg/L。A、格利斯溶液：在加热下溶解0.5g对氨基苯磺酸于50mL30％乙酸中，于暗处保存。将0.4g1-萘酚与100mL水混合煮沸，在从蓝色渣滓中倾出的无色溶液中加入6mL80％乙酸，放棕色瓶中保存。B、标准浓度的NaNO2配制：Ⅰ、取0.10gNaNO2溶解于蒸馏水中，定容，至1000mL，NaNO2浓度为100mg/L。Ⅱ、取(I)溶液5mL用蒸馏水稀释，定溶，至200mL，此时NaNO2浓度为2.5mg/L。(2)实验仪器：酶标仪、96孔板、容量瓶，150mL三角瓶、量筒、移液枪(3)实验原理酸性条件下，亚硝酸盐与对-氨基苯磺酰胺反应，生成重氮盐，再与N-(1-萘基)-乙二胺偶联生成红色染料。在540nm波长处有最大吸收。(4)测定方法：A标准曲线制作：向96孔板加入0μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL2.5mg/LNaNO2标准溶液，分别加入蒸馏水200μL、180μL、160μL、140μL、120μL、100μL，加入格利斯Ⅰ混匀，静止3min，加入格利斯Ⅱ混合均匀，在波长540nm处测吸光度，绘制标准曲线(见图1)B样品测定：水样中亚硝酸盐(按NO2-计)浓度以mg/L表示，按下列计算C＝M/V式中：C-----------------水样中亚硝酸盐浓度mg/LM----------------冲校准曲线上查得亚硝酸盐含量，μgV-----------------取样体积实施例2施氏假单胞菌F2的筛选(1)LB培养基的配置：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g(2)亚硝酸菌株的筛选：LB培养基中添加25mg/L的亚硝酸盐，将菌株接种到培养基中，培养24h，测定发酵液中剩余的亚硝酸盐的浓度，进而计算亚硝酸降解率。降解率＝(25mg/L-发酵液中剩余亚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株F2，其保藏编号为CGMCCNo.17258。/n
【技术特征摘要】
1.一株施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)菌株F2，其保藏编号为CGMCCNo.17258。
2.如权利要求1所述的施氏假单胞菌菌株F2，其特征在于，其16srRNA基因序列如SEQIDNo.1所示。
3.含有权利要求1或2所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液。
4.如权利要求3所述的所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液中，施氏假单胞菌菌株F2的活菌数为1.0×108～109cfu/mL。
5.如权利要求3或4所述的发酵液，其特征在于，还含有腐殖酸和/或其盐。
6.如权利要求5所述的发酵液，其特征在于，所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液与所述的腐殖酸和/或其盐的体积质量比(ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：易敢峰，付维来，王云爽，王佳一，周志刚，林克冰，姜波，
申请(专利权)人：福建大北农水产科技有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司，天津昌农科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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